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水稻黄单胞菌tal（transcription activator-like）基因功能研究

作　者: 曹燕飞
导　师: 陈功友
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水稻白叶枯病菌水稻细菌性条斑病菌 tal 基因敲除基因分离
分类号: S435.111.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

水稻的两个模式病原菌水稻细菌性条斑病菌(简称水稻条斑病菌)(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)和水稻白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae, Xoo)同属于稻黄单胞菌种下致病变种,分别引起水稻细菌性条斑病(bacterial leaf streak, BLS)和水稻白叶枯病(bacterial blight, BB)。BB是水稻上最为严重的病害之一,而BLS也趋于逐年加重。水稻是世界上主要粮食作物和作物生物学的模式植物,研究Xoo及Xoc与其的互作对于世界粮食安全问题意义重大。水稻白叶枯病菌与水稻互作符合基因对基因关系,不同小种中存在特异的tal家族基因。PX099A是Xoo代表菌株菲律宾6号小种,2008年PX099A全基因组信息发布,该菌株中的19个tal基因以9个簇的形式存在。为了揭示tal基因在水稻上的毒性贡献、在水稻上的互作关系以及tal基因间的协同性和抑制性,本研究根据PX099A菌株的基因组学特性,依据tal基因结构上的保守性和大小不同,对其19个tal基因进行了分离,成功获得17个tal基因(19个tal基因中有2对相同),并将这17个tal基因构建到研究tal基因功能的通用载体pUAV45K(B)中。这为揭示tal基因在水稻上的毒性贡献奠定了材料基础。水稻条斑病菌中存在20多个在结构上高度保守的tal的贡献,为了研究其功能,逐一减少水稻条斑病菌中的tal基因数量,据认为是较好的技术途径。本研究依据tal基因结构上的保守性,利用同源重组策略,借助自杀性载体pKMS1介导,对水稻条斑病菌RS105菌株中的tal基因进行了敲除。结果发现,同源交换可通过基因内和基因间重组实现tal基因敲除。PCR和Southern杂交结果显示,水稻条斑病菌中有5个tal基因被成功敲除,表明水稻条斑病菌tal基因敲除体系构建成功。毒性测定结果表明随着tal基因缺失数目的增多,突变体菌株的毒性减弱。这为逐一评价tal基因的毒性或／和无毒性功能奠定了基础。水稻条斑病菌与水稻白叶枯病菌在DNA水平上有大于90%的相似性,它们侵染寄主的方式不同,在水稻上激发的抗性基因也有很大不同。两种菌都含有大量的tal基因,但是Xoc中的tal基因功能还不清楚。本研究对Xoc的RS105菌株的tal基因进行分离,将分离得到的单个tal基因分别构建到含来自于Xoo的avrXa7和avrXalO的载体中。为分别在含有Xa7和Xa10的抗性水稻品种IRBB7和IRBB10中表达,以探寻在Xoc中抑制avrXa7和avrXalO表达的抑制因子建立了筛选体系。

全文目录

摘要 7-9ABSTRACT 9-11文献综述 11-24 水稻黄单胞菌tal基因的研究进展 12-21 1 tal家族基因的命名 12-13 2 tal家族基因的特征及在基因组中的分布 13-15 3 tal家族基因的功能 15-19 3.1 tal家族基因的无毒性作用 16-17 3.2 tal家族基因的毒性作用 17-18 3.3 tal家族基因先天免疫抑制作用 18-19 4 tal家族基因的进化 19 5 TAL box 19-20 6 展望 20-21 参考文献 21-24研究内容 24-74 第一章水稻白叶枯菌PX099~A菌株tal基因的分离 26-48 1 材料与方法 27-38 1.1 菌株与质粒 27 1.2 培养基 27-28 1.3 所用抗生素的浓度 28 1.4 主要试剂、PCR引物设计与合成 28-29 1.5 tal基因BamHI片段的回收 29-33 1.6 tal基因BamHI片段阳性克隆获取 33-38 2 结果与分析 38-43 2.1 获得含有tal基因片段的阳性克隆 38-40 2.2 阳性克隆定位分析 40-41 2.3 tal基因BamHI片段构建到通用载体 41-43 2.4 tal基因导入到PXO99~A突变体菌株中 43 3 讨论 43-45 参考文献 45-48 第二章水稻条斑病菌tal基因敲除及其毒性评价体系的建立 48-64 1 材料与方法 49-54 1.1 菌株和质粒 49 1.2 引物的设计与合成 49 1.3 培养基 49-51 1.4 所用抗生素的浓度 51 1.5 试剂与仪器 51-52 1.6 敲除载体的构建 52 1.7 基因敲除 52 1.8 PCR检测 52 1.9 Southern杂交验证 52-53 1.10 水稻接种实验 53-54 2 结果与分析 54-60 2.1 水稻条斑病菌中至少存在20个以上的tal基因 54 2.2 多个tal基因被敲除 54-57 2.3 基因敲除机制分析 57-58 2.4 tal基因缺失突变体在水稻上的病斑长度测定 58-60 3 讨论 60-62 参考文献 62-64 第三章水稻条斑病菌抑制avr-R互作的抑制因子筛选体系构建 64-74 1 材料与方法 65-67 1.1 菌株与质粒 65 1.2 培养基 65 1.3 所用抗生素的浓度 65-66 1.4 主要试剂、PCR引物设计与合成 66 1.5 RS105菌株中tal基因BamHI片段的回收 66 1.6 tal基因BamHI片段阳性克隆获取 66 1.7 阳性克隆的验证 66-67 1.8 PBBS载体构建 67 1.9 tal基因BamHI片段连接至PBBS载体 67 1.10 tal基因分别构建到含avrXa7和avrXa10的pUAV45K(B) 67 2 结果与分析 67-71 2.1 获得含有RS105菌株tal基因片段的阳性克隆 67-68 2.2 阳性克隆定位分析 68 2.3 PBBS载体的构建 68-70 2.4 实现RS105菌株来源的tal基因连接至PBBS 70-71 3 讨论 71-72 参考文献 72-74全文总结 74-76硕士期间发表论文 76-78致谢 78

水稻黄单胞菌tal（transcription activator-like）基因功能研究

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