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高尔基体磷酸蛋白2应对炎症以及肝损伤的生理功能研究

作　者: 龙琪
导　师: 彭涛
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: GOLPH2 肝炎和肝损伤 IL-1b IL-6 GOLPH2基因敲除鼠
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

高尔基体磷酸蛋白2(GOLPH2, GP73)是的一个功能未知的高尔基体二型跨膜蛋白,定位在高尔基体顺面,并能够通过细胞内膜系统转运分泌到细胞外基质。临床和病理研究表明,GOLPH2与疾病关系密切,尤其在肝炎肝癌和肝炎患者中发现有GOLPH2异常高表达,并且能够分泌到血液,从而可能作为临床诊断肝癌的血清学标志物。目前关于GOLPH2异常表达的研究主要集中在临床研究方面,而针对GOLPH2在肝炎和肝损伤中异常表达的细胞和分子机制研究较少,这限制了GOLPH2在临床上的应用和价值。本研究主要应用动物和细胞模型,研究GOLPH2在肝炎和肝损伤过程中异常表达的过程和部分机制,并初步探讨了GOLPH2异常表达的意义。应用肝炎动物模型和肝损伤动物模型,可以跟踪肝炎和肝损伤的发生和进展过程。研究发现GOLPH2对肝炎和肝损伤的反应非常迅速和灵敏,肝脏受到LPS或者CCl4刺激后24h内,GOLPH2表达水平就迅速升高,并在损伤后48h,达到高峰;同时肝炎以及肝损伤修复进入尾声时,GOLPH2水平缓慢下降,GOLPH2水平的下降可能还与愈后相关。GOLPH2在肝脏炎症反应中的异常表达可能是炎症因子(细胞因子)的调节结果,使用细胞因子体外刺激小鼠原代肝细胞以及肝癌细胞系Hep3B细胞,检测GOLPH2表达。结果显示IL-1b以及IL-6有上调GOLPH2的作用,而TGF-b能够显著下调肝细胞GOLPH2表达水平;没有检测到TNF-a以及IFN-r对GOLPH2的调节效果。这部分研究结果表明GOLPH2可能与肝炎过程中免疫细胞分泌的IL-1b、IL-6表达水平升高相关。为了进一步研究GOLPH2在肝炎中表达是否存在生理意义,我们第一次构建和使用了GOLPH2基因敲除鼠模型,使用Cre-Loxp系统敲除GOLPH2基因外显子5,结果显示GOLPH2存在一种尚未发现的新的可变剪接方式,外显子6的5’端存在2个剪接位点,使得GOLPH2可以选择两个不同的位置连接外显子6,属于可变剪接中的可变3’端剪接方式。由于事先未知的可变剪接的存在,使得GOLPH2敲除鼠变成了外显子5缺失的突变鼠,本研究初步研究了外显子5缺失突变对个体生殖发育有影响,并可能降低了肝脏应激能力。综合研究结果显示,肝脏GOLPH2异常表达可能是肝脏的一种应激形式,并与损伤修复过程密切联系,可能参与了这个过程,同时GOLPH2有较强的应对突变的能力,我们发现了GOLPH2新的可变剪接模式。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第1章绪论(GOLPH2 基因与肝脏疾病密切相关)  11-21
  1.1 GOLPH2 基因的发现与性质  11-12
  1.2 GOLPH2 与肝脏疾病关系密切  12-13
  1.3 肝炎与肝损伤  13-15
  1.4 基因敲除动物  15-17
  1.5 可变剪接（Alternative splicing）  17-19
  1.6 总结  19-21
第2章 GOLPH2 基因表达谱分析  21-32
  2.1 实验材料  21-22
    2.1.1 实验动物  21
    2.1.2 特殊试剂  21
    2.1.3 常用溶液  21-22
  2.2 实验方法  22-25
    2.2.1 小鼠饲养  22
    2.2.2 Western blot  22-24
    2.2.3 免疫组织化学  24
    2.2.4 组织免疫荧光  24-25
  2.3 实验结果  25-30
    2.3.1 概括  25
    2.3.2 消化系统  25-26
    2.3.3 生殖与泌尿系统  26-27
    2.3.4 神经系统  27-28
    2.3.5 造血与免疫系统  28
    2.3.6 内分泌系统  28
    2.3.7 呼吸系统和心脏  28-29
    2.3.8 总结  29-30
  2.4 分析与讨论  30-32
第3章 GOLPH2 基因敲除鼠的制备与初步分析  32-48
  3.1 实验材料  32-33
    3.1.1 实验动物  32
    3.1.2 生化试剂  32
    3.1.3 PCR 鉴定引物  32-33
    3.1.4 实验仪器  33
  3.2 实验方法  33-38
    3.2.1 基本实验方法  33-36
    3.2.2 GOLPH2 Loxp 重组鼠制备  36-37
    3.2.3 敲除鼠繁育  37
    3.2.4 敲除鼠鉴定  37-38
    3.2.5 RNA Alternative splicing  38
  3.3 实验结果  38-45
    3.3.1 选定敲除区域  38-39
    3.3.2 基因打靶结果  39-40
    3.3.3 敲除鼠繁育结果  40-41
    3.3.4 敲除鼠鉴定结果  41-43
    3.3.5 mRNA 可变剪接  43-44
    3.3.6 敲除鼠基本表型  44-45
  3.4 分析与讨论  45-48
第4章 GOLPH2 与炎症关系探索  48-60
  4.1 实验材料  48-49
    4.1.1 实验动物和细胞  48
    4.1.2 试剂和溶液  48
    4.1.3 抗体  48-49
  4.2 实验方法  49-52
    4.2.1 细胞培养  49
    4.2.2 原代肝细胞分离培养  49-50
    4.2.3 疟原虫接种和血虫水平检测  50-51
    4.2.4 LPS 肝炎模型  51
    4.2.5 细胞因子刺激实验  51
    4.2.6 Real-Time PCR 检测  51-52
  4.3 实验结果  52-58
    4.3.1 GOLPH2 与疟疾感染的关联  52-54
    4.3.2 GOLPH2 在LPS 肝炎模型中的表达  54-56
    4.3.3 GOLPH2 应对炎症因子的反应  56-58
  4.4 分析与讨论  58-60
第5章 GOLPH2 基因与肝损伤关系探索  60-70
  5.1 实验材料  60-61
    5.1.1 动物与细胞  60
    5.1.2 质粒  60
    5.1.3 特殊试剂  60-61
  5.2 实验方法  61-63
    5.2.1 CC14 肝损伤模型建立  61
    5.2.2 BrdU 标记检测细胞增殖  61-62
    5.2.3 高表达和低表达GOLPH2 的稳定细胞系筛选  62-63
    5.2.4 细胞迁移实验  63
  5.3 实验结果  63-68
    5.3.1 CC14 肝损伤模型的建立  63-64
    5.3.2 GOLPH2 在肝损伤后表达升高  64-65
    5.3.3 GOLPH2 缺失影响肝脏损伤后修复  65-67
    5.3.4 GOLPH2 对肝细胞增殖的影响  67
    5.3.5 GOLPH2 对细胞迁移的影响  67-68
  5.4 分析与讨论  68-70
第6章总结  70-73
参考文献  73-76
附录1 缩略词表  76-77
致谢  77

高尔基体磷酸蛋白2应对炎症以及肝损伤的生理功能研究

内容摘要

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