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血管紧张素Ⅱ诱导动脉粥样硬化斑块中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子表达的实验研究

作　者: 杨智华
导　师: 杨丽霞
学　校: 第三军医大学
专　业: 内科学
关键词: 血管紧张素Ⅱ 动脉粥样硬化斑块 载脂蛋白E基因敲除小鼠 细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 缬沙坦 核因子-κB
分类号: R541.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


研究背景及目的急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)已成为目前威胁人类健康的“头号杀手”,其发生机制为易损斑块的破裂。易损斑块的结构特点为:薄的偏心性纤维帽,富含脂质粥样坏死中心,斑块周围炎症细胞大量浸润。既往研究证实血管紧张素II(angiotensinII,AngII)在ACS的发生中有重要作用,随着研究深入发现,AngII在动脉粥样硬化斑块中与基质金属蛋白酶(metalloproteinases,MMPs)共定位,并诱导斑块内巨噬细胞、泡沫细胞、平滑肌细胞表达MMPs,MMPs能降解纤维帽基质,从而导致斑块破裂,使斑块失去稳定性。大量实验证实AngII在体内发挥其生物学效应主要是通过血管紧张素II1型受体(AT1R)介导的。多项大型临床试验证实应用ACEI、ARB可明显减少稳定性心绞痛及ACS患者的心血管病死亡率及全因死亡率并不依赖于血压的降低,但其中的相关机制目前尚不完全清楚。MMPs是参与降解易损斑块薄纤维帽的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的关键因子。由于MMPs在动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞、平滑肌细胞内高表达,并起到降解细胞外基质作用,被证实与动脉粥样硬化、ACS发生有着密不可分的联系。随着研究深入,作为诱导MMPs产生及分泌的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)在人动脉粥样硬化斑块的血管内膜、血管平滑肌细胞以及斑块内高表达。还有研究显示,在急性心肌梗死患者EMMPRIN表达增强,EMMPRIN刺激单核细胞/巨噬细胞表达MMP-9、平滑肌细胞表达MMP-2,而在稳定型心绞痛患者则不增强。诸多研究证实MMPs及其上游因子-EMMPRIN在促进基质的降解、导致ACS的发生等方面同样起着极其重要的作用。核因子-κB(Nuclear factor–kappaB,NF-κB)是一个重要的转录因子,最广泛地参与体内免疫应答、炎症反应、细胞生长和凋亡,在动脉粥样硬化斑块形成及破裂中亦发挥重要作用。已经有研究显示,NF-κB在动脉粥样硬化斑块中高表达,并且定位于巨噬细胞及平滑肌细胞中,通过抑制NF-κB活性,能够下调炎症反应,与斑块稳定性相关。最新研究表明,EMMPRIN是NF-κB又一新受体,在单核细胞内发挥诱导炎症反应、MMPs和细胞因子表达作用。且导师各项前期研究证实AngⅡ能通过NF-κB调控EMMPRIN下游因子-MMPs的表达,但在体研究AngⅡ与MMPs诱导因子EMMPRIN是否存在联系尚未见报道。此实验以能够形成与人类动脉粥样硬化病理学形态极为相似的载脂蛋白E基因敲除小鼠高脂饮食饲养建立动脉粥样硬化模型,在体探讨AngII在动脉粥样硬化斑块中对EMMPRIN表达及调节作用:1、AngII是否可诱导动脉粥样硬化斑块中EMMPRIN的表达;2、AngII诱导EMMPRIN的表达上调是否通过AT1受体,AT1受体拮抗剂可否抑制该表达;3、AngII诱导EMMPRIN的表达是否通过NF-κB信号通路。从而为临床防治ACS提供新的理论依据和新的药物靶点。实验方法1、建立动脉粥样硬化模型和实验分组:28只6周龄雄性ApoE-/-小鼠按照普通小鼠饲料+21%猪油+0.15%胆固醇比例配制高脂饮食饲料,饲养12周建立动脉粥样硬化模型。小鼠随机分为4组,每组7只。药物干预小鼠:AngII组背部埋入预装入AngII的微量渗透泵,以750mg.kg-1.d-1持续药物干预4周。Val组给予AngII干预法同上,同时给予缬沙坦混悬液40mg.kg-1.d-1灌胃,干预4周。对照1组、对照2组分别给予200ul生理盐水干预,方法同上,对照1组高脂饲养4周,对照2组高脂饲养8周。2、血脂检测:ApoE-/-小鼠处死前取血清,Olympus Au2700全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。3、苏木精-伊红染色:取ApoE-/-小鼠主动脉、头臂动脉制备石蜡切片,脱蜡后用苏木精-伊红(HE)染色,观察主动脉及头臂动脉动脉粥样硬化斑块形态。4、RT-PCR:取ApoE-/-小鼠主动脉,液氮中研磨后加入1mlRNA OUT,按说明书进行提取,紫外分光光度计测定RNA OD260/280的比值及量。取总RNA1μg,根据RT盒的说明书操作,以Oligo-dT20进行cDNA的合成。基因EMMPRIN、MMP-9、β-actin进行PCR扩增的引物序列分别是:EMMPRIN :上游: 5’- GGCAAGATAGTGGTGGTATCC- 3’,下游: 5’- AGTGAGATGGTTTCCCGAGTAG- 3’;MMP-9:上游: 5’- TGCCGTCCTTATCGTAGTCAG- 3’,下游: 5’- GTCACTTTCCCT TCA CCTTCG -3’;β-actin:上游: 5’- AGATTACTGCTCTGGCTCCTAGC- 3’,下游: 5’- ACTC ATCGTACTCCTGCTTGCT- 3’。RT-PCR仪扩增目的基因后用1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪分析。5、实时RT-PCR:总RNA提取、cDNA合成同前,基因表达用SYBR Green1荧光定量PCR进行分析。6、蛋白提取和Western blot:取ApoE-/-小鼠主动脉,液氮中研磨后加入预冷的RIPA裂解液裂解组织,收集裂解的组织在4℃下,20000g离心30min,蛋白浓度用考马斯亮蓝法来测定。取87.5μg总蛋白样品与上样缓冲液,混匀后100℃煮5 min,在11%SDS-PAGE中行垂直电泳(40-65V,120min),室温50V×120min转样品至PVDF膜,6.0 %脱脂奶粉在4℃下温和振荡封闭过夜。取出膜结合相应的一抗羊抗鼠EMMPRIN多克隆抗体,浓度为1:200;鼠抗鼠β-actin单克隆抗体,浓度为1:2000),室温振荡1h,TBST洗膜后,结合相应的二抗(兔抗羊辣根酶标二抗,浓度为1:2500;羊抗鼠辣根酶标二抗,浓度为1:2500),室温1h。用化学发光试剂盒与PVDF膜共孵育1min后,将PVDF膜与X光片放入暗盒内曝光3min,显影后再定影。扫描胶片,用软件分析条带光密度值,以β-actin蛋白表达作对照作半定量分析。7、明胶酶谱法:取ApoE-/-小鼠主动脉,液氮中研磨后加入组织提取液,加入PMSF后,4℃,12000g离心20min,收集裂解的组织在4℃下,20000g离心30min,蛋白浓度用考马斯亮蓝法测定。调整蛋白浓度,等量上样行明胶电泳,凝胶依次行洗脱、染色,脱色,检测MMP -9位于蓝色背景上的透亮带(92 KD)。8、EMSA及Supershift:取ApoE-/-小鼠主动脉,按照试剂盒说明提取核蛋白,上清液即为核蛋白,蛋白浓度用考马斯亮蓝法来测定。加入各组反应物,在4%非变性聚丙稀酰胺凝胶中电泳,200V×2h,干胶后放射自显影,显影后再定影。Bio-Rad软件检测条带密度。结果1、成功建立动脉粥样硬化动物模型:ApoE-/-小鼠在高脂饮食(普通小鼠饲料+21%猪油+0.15%胆固醇)12周后,主动脉大体标本油红染色倒置相差纤维镜下观察小鼠主动脉内大量动脉粥样硬化斑块形成,石蜡切片HE染色倒置相差纤维镜下观察小鼠主动脉内粥样硬化斑块形成,斑块内大量泡沫细胞形成和堆积,主动脉内膜增厚,并突向管腔。2、ApoE-/-小鼠头臂动脉及主动脉石蜡切片HE染色倒置相差纤维镜下观察结果显示,小鼠头臂动脉内粥样硬化斑块形态与主动脉相比斑块内泡沫细胞形成和堆积明显增多,主动脉内膜明显增厚,并突向管腔,斑块稳定性差,较易损。3、AngII刺激ApoE-/-小鼠主动脉及粥样硬化斑块内EMMPRIN、MMP-9基因及蛋白的表达:对照1组、对照2组、AngII组ApoE-/-小鼠主动脉分别用RT-PCR、Real-Time PCR及Western blot、免疫组化、明胶酶谱法检测基因及蛋白的表达。结果显示AngII组EMMPRIN、MMP-9基因及蛋白的表达与对照1、2组相比明显增加,差别均有统计学意义(P< 0.05,基因及蛋白的表达都以β-actin作为内对照)。4、缬沙坦可阻滞AngII引起的ApoE-/-小鼠主动脉及粥样硬化斑块中EMMPRIN、MMP-9的上调作用:为证明AngII是通过AT1受体诱导EMMPRIN、MMP-9的上调作用,Val组小鼠同时给予AngII和缬沙坦干预后,分别用RT-PCR、Real-Time PCR及Western blot、明胶酶谱法、免疫组化法检测小鼠主动脉及粥样硬化斑块内EMMPRIN、MMP-9基因及蛋白的表达;实验结果显示,Val组主动脉内EMMPRIN、MMP-9的基因及蛋白的表达与AngII组相比显著降低,差别均有统计学意义(P< 0.05)。AngII引起的ApoE-/-小鼠主动脉及粥样硬化斑块中EMMPRIN、MMP-9的上调作用是通过AT1受体诱导的,其作用可被缬沙坦所阻断。5、AngII通过AT1R/NF-κB途径诱导ApoE-/-小鼠主动脉中EMMPRIN表达上调:对照1组、对照2组、AngII组、Val组ApoE-/-小鼠主动脉用EMSA及Supershift法检测NF-κB的转录结合活性。加入核蛋白特异型抗体为对照。结果显示AngII能够诱导ApoE-/-小鼠主动脉产生NF-κB活性,这一过程可被NF-κB p65蛋白抗体所被抑制。结论1、AngII可诱导ApoE-/-小鼠主动脉、动脉粥样硬化斑块中EMMPRIN、MMP-9的表达。2、AngII上调ApoE-/-小鼠主动脉、动脉粥样硬化斑块中EMMPRIN、MMP-9表达通过AT1R,ARB(缬沙坦)可抑制其上调作用。3、该调节作用中存在着AngII/NF-κB/EMMPRIN这一信号通路。

全文目录


英文缩写一览表  4-5
英文摘要  5-10
中文摘要  10-14
前言  14-17
第一部分 动物模型的建立及药物干预后动脉粥样硬化斑块形态的观察  17-28
  材料与方法  17-22
  结果  22-26
  讨论  26-27
  小结  27-28
第二部分 AngⅡ 对ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块EMMPRIN 表达的影响  28-49
  材料与方法  28-40
  结果  40-47
  讨论  47-48
  小结  48-49
第三部分 AT1R、NF-κB在AngⅡ诱导ApoE--/-小鼠主动脉粥样硬化斑块中EMMPRIN表达中的作用  49-69
  材料与方法  49-57
  结果  57-66
  讨论  66-68
  小结  68-69
全文总结  69-70
致谢  70-71
参考文献  71-75
文献综述 易损斑块分子机制的研究进展  75-82
  参考文献  78-82
在读硕士期间发表论文  82

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 心脏疾病 > 冠状动脉（粥样）硬化性心脏病（冠心病）
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