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稻瘟病菌Rho2同源蛋白的功能分析

作　者: 杨帆
导　师: 王宗华
学　校: 福建农林大学
专　业: 微生物学
关键词: 稻瘟病菌 Rho2 GTP酶基因敲除附着胞形成
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

小G蛋白是真核生物细胞信号转导过程中重要的蛋白超家族,可分为8个不同的家族:Arf、Ran、Rab、Rho、Ras、Sar1、Mitochondrial Rho、Roc small GTPases domain,拥有一个共同的结构保守的GTP结合结构域。Rho家族GTP酶主要调控细胞骨架重组。真菌中,Rho1主要调控细胞的形态建成,Rho2、Rho3以及Rho4对真菌的细胞分化和极性生长有影响。本研究通过生物信息学的方法,利用相应的计算机软件及数据库,对稻瘟病菌Rho2蛋白氨基酸序列进行分析和预测。对其理化性质、蛋白结构域、同源性、蛋白基序(motif)搜索和酶切位点预测以及蛋白序列系统演化关系做了详细的分析。进一步通过构建基因敲除突变体研究基因功能。MgRho2基因敲除突变体产孢量正常,菌落生长与野生型相比无明显差异,分生孢子和菌丝隔膜无变化,但是分生孢子的附着胞形成相对滞后于野生型,而随着时间的延长,分生孢子附着胞的形成与野生型达到相同的水平。洋葱表皮侵染实验表明,MgRho2基因敲除突变体能够产生正常的侵入栓侵入洋葱表皮,但是相对于野生型,侵入栓形成率较低,这与分生孢子的附着胞形成延迟相对应。将敲除突变体接种水稻CO39,及对大麦叶片进行离体接种,结果表明突变体发病情况与野生型没有差别。说明了不象其他Rho族成员在稻瘟病菌致病性中起重要调控作用,MgRho2主要影响该菌的附着胞发育,其机制有待进一步研究。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-9
1 引言  9-18
  1.1 稻瘟病菌侵染调控的信号途径  10-13
    1.1.1 cAMP信号途径  10-11
    1.1.2 Ca~(2+)信号途径  11
    1.1.3 MAPK 信号传导途径  11-13
  1.2 Rho 蛋白及其对真菌生长发育和侵染致病的调控  13-17
  1.3 稻瘟病菌中 Rho2 同源蛋白功能的研究意义  17-18
2 材料与方法  18-27
  2.1 试验材料  18-19
    2.1.1 供试菌株  18
    2.1.2 供试植物  18
    2.1.3 供试质粒  18
    2.1.4 试验试剂  18
    2.1.5 常用培养基  18-19
    2.1.6 引物  19
  2.2 研究方法  19-27
    2.2.1 稻瘟病菌 MgRho2 的生物信息学分析  19-20
      2.2.1.1 MgRho2 蛋白序列的获得及理化性质分析  19-20
      2.2.1.2 生物信息分析 MgRho2 分泌特性  20
      2.2.1.3 MgRho2 蛋白结构域与同源性分析  20
      2.2.1.4 MgRho2 蛋白基序(motif)搜索和酶切位点预测  20
      2.2.1.5 蛋白序列系统演化关系分析  20
    2.2.2 稻瘟病菌基因组DNA 的提取  20-21
    2.2.3 DNA 琼脂糖电泳  21
    2.2.4 普通 PCR 反应  21
    2.2.5 MgRho2 基因敲除突变体载体的构建  21-23
    2.2.6 克隆 PCR 产物  23
    2.2.7 制备 E.coli DH5α 感受态细胞  23-24
    2.2.8 细菌转化  24
    2.2.9 提取质粒 DNA  24
    2.2.10 质粒的酶切与质粒连接  24-25
    2.2.11 稻瘟病菌原生质体制备以及原生质体转化  25-26
    2.2.12 稻瘟病菌菌落生长速度测定  26
    2.2.13 产孢量统计及细胞形态观察  26
    2.2.14 孢子萌发及附着胞形成观察  26
    2.2.15 洋葱表皮侵染观察  26-27
    2.2.16 大麦菌丝块离体接种试验  27
    2.2.17 水稻菌丝块离体接种试验  27
    2.2.18 造伤离体接种  27
3 结果与分析  27-43
  3.1 稻瘟病菌MgRho2的生物信息学分析结果  27-34
    3.1.1 稻瘟病菌MgRho2的理化性质  27
    3.1.2 稻瘟病 MgRho2 分泌特性分析  27-30
    3.1.3 稻瘟病菌 MgRho2 蛋白功能域预测分析  30-31
    3.1.4 稻瘟病 MgRho2 蛋白基序分析和酶切位点预测  31-33
    3.1.5 MgRho2的系统演化分析  33-34
  3.2 MgRho2 敲除突变体的获得  34-35
  3.3 MgRho2 基因敲除突变体菌落生长速率测定  35-36
  3.4 MgRho2 基因敲除突变体细胞形态观察与产孢量测定  36-38
  3.5 MgRho2 基因敲除突变体分生孢子萌发以及附着胞形成统计  38-40
  3.6 MgRho2 基因敲除突变体侵染洋葱表皮分析  40-41
  3.7 MgRho2 基因敲除突变体接种大麦分析  41-42
  3.8 MgRho2基因敲除突变体侵染水稻分析  42-43
4 讨论和小结  43-46
参考文献  46-52

稻瘟病菌Rho2同源蛋白的功能分析

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