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PhoQ/PhoP与外膜蛋白OprH在铜绿假单胞菌对氨基糖甙类抗生素耐药性中的相互关系和作用机制

作　者: 汪浙炯
导　师: 严杰
学　校: 浙江大学
专　业: 病原生物学
关键词: 铜绿假单胞菌 phoQ/phoP基因 oprH基因原核表达基因敲除氨基糖苷类抗生素耐药性 RT-PCR
分类号: R446.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的分析氨基糖苷类抗生素敏感或耐药铜绿假单胞菌菌株二元信号系统PhoQ/PhoP及外膜蛋白OprH编码基因,因并确定与二元信号系统PhoQ/PhoP编码基因在氨基糖甙类抗生素耐药性中的相互关系和作用机制。方法采用PCR获得铜绿假单胞菌菌株全长phoQ/phoP和oprH基因片段,T-A克隆后测序。构建phoQ/phoP和oprH基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rphoQ、rphoP和roprH,皮内注射免疫法制备兔抗血清,免疫双扩散法测定抗血清效价。采用Red重组系统敲除氨基糖苷类抗生素耐药铜绿假单胞菌菌株phoQ、phoP和oprH基因,采用PCR、测序和Western Blot对phoQ-、phoP-和oprH突变株进行鉴定。采用试管稀释法测定各铜绿假单胞菌野生株和突变株对4种氨基糖苷类抗生素的MIC,荧光定量RT-PCR检测突变株未敲除基因的mRNA水平。结果与GenBank中相关序列比较,所克隆的phoQ、phoP和基因核苷酸和氨基酸相似性分别为98.4%-99.8%和99.1%～100.0%、98.7%-99.6%和98.7-100%、97.3%～99.5%和96.0%～100.0%；采用pET42a和E.coli BL21DE3系统成功地表达了rPhoQ、rPhoP和rOprH。rPhoQ、rPhoP和rOprH兔抗血清免疫双扩效价分别为1：4、1：8和1：8抗血清。经PCR、测序和Western Blot鉴定,phoQ-、phoP-和oprH-突变株phoQ、phoP和oprH基因及产物均缺失。phoQ-突变株以及上述phoP-和oprH-突变株对4种氨基糖苷类抗生素的MIC值分别为其野生株的1/512-1/2048、1/512-1/1024和1/256-1/1024。160756突变株的未敲除基因的mRNA水平均明显低于耐药菌株160756株。结论PhoQ/PhoP是序列保守的铜绿假单胞菌二元信号传导系统,该系统介导细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性。oprH是序列保守的,oprH基因是PhoQ/PhoP在铜绿假单胞菌对氨基糖甙类抗生素耐药性中的一条通路。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-7
Abstract  7-9
目次  9-10
引言  10-14
第一部分 phoP phoQ oprH基因序列的测定并构建其原核表达系统  14-41
第二部分目的的重组蛋白的表达、纯化与抗体制备  41-50
第三部分基因敲除急耐药性分析  50-57
讨论  57-60
参考文献  60-64
综述  64-72
  参考文献  69-72
作者简历与攻读学位期间取得的科研成果  72

PhoQ/PhoP与外膜蛋白OprH在铜绿假单胞菌对氨基糖甙类抗生素耐药性中的相互关系和作用机制

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