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新型乙醇诱导表达系统的初步研究及植物双元表达载体的构建

作　者: 王慧
导　师: 徐杰；姚磊
学　校: 内蒙古师范大学
专　业: 植物学
关键词: 乙醇诱导 启动子 双元表达载体 草甘膦 进化树
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


来源于构巢曲霉组成的乙醇诱导系统由两部分组成,分别为AlcR蛋白和一个诱导型启动子,乙醇存在条件下,可改变AlcR蛋白构象,使得原本没有活性的蛋白激活,激活后蛋白会识别诱导型启动子,如alcA启动子上AlcR特异性识别位点,激活启动子进一步使得目的基因表达。乙醇诱导系统可在时间和空间上控制目的基因的表达,利用乙醇诱导系统AlcR/alcA进行标记基因的删除验证试验中发现,未诱导条件下乙醇诱导系统AlcR/alcA在原核生物中为组成型表达。为了研发新型乙醇诱导系统,使其在原核生物及真核生物中均为诱导型表达。对同alcA一样受到AlcR调控的启动子进行研究。实验中以构巢曲霉基因组为模板,克隆了alcS、alcM、alcP、alcU、alcR、alcA、aldA自然启动子并测序正确,构建载体pUC19-alcX(aldA)-Cre,利用Cre蛋白可识别两个同向loxp位点并发生删除或重组的Cre/loxp位点特异性重组系统,在原核生物大肠杆菌E.coli中验证在未诱导条件下,自然启动子的启动Cre蛋白表达而删除或重组两个同向loxp位点之间抗性基因情况。具体实验结果为：(1)自然启动子alcS在原核生物中,未诱导条件下启动了Cre表达,并删除了pYBA100中两个同向loxp位点之间的抗性基因片段；(2)自然启动子alcA、alcU和alcR在原核生物中,未诱导条件下启动Cre表达,并且pYBA100中两个同向loxp位点之间抗性片段发生重组现象；(3)自然启动子alcP、alcS与aldA在原核生物中,未诱导条件下没有启动Cre表达,pYBA100中两个同向loxp位点之间的抗性基因没有发生删除及重组现象。实验结果表明,在原核生物中未诱导条件下,自然启动子alcP、alcS与aldA没有启动Cre表达而发生删除或重组现象,为无泄漏启动子；自然启动子alcA、alcU、alcS和alcR启动了Cre表达而使得两个同向loxp位点之间片段发生删除或重组,为组成型表达启动子。随着除草剂抗性的转基因作物大面积推广种植,抗草甘膦转基因作物作为其中一种得到了广泛关注,而获得草甘膦抗性基因的研究日益增多。在关于抗草甘膦的已注册专利的EPSP合成酶编码序列中发现,来源于农杆菌C58的EPSPS基因仅在原核生物中进行了抗性鉴定,未在植物中进行抗性验证。本研究在以根癌农杆菌C58为模板扩增EPSPS测序正确并改造后,构建了双元表达载体,利用农杆菌介导方法转入拟南芥中。对筛选的转基因阳性苗进行草甘膦浓度抗性测定,实验结果为：在转基因叶片涂施草甘膦浓度为0.02%条件下,转基因阳性苗变黄枯萎,表现抗性低。在此基础上对近年国内获得关于抗草甘膦的基因15项专利进行总结,并对抗草甘膦基因的氨基酸序列建立了系统发育进化树进行分析。所得结果为：(1)来源于农杆菌C58的EPSPS抗性基因在植物中对草甘膦耐性极低,无实际应用价值；(2)利用这些基因的蛋白序列与已知的一些EPSPS蛋白序列建立进化树分析,发现可以按是否含保守序列LGNAGTA将其分为两类；(3)Ⅰ型中(除专利9[87]外)含LGNAGTA保守序列,Ⅱ型中则不含有；(4)源于植物的EPSPS都属于Ⅰ型。新型乙醇诱导系统可用于外源基因的表达,并可在时间和空间上进行调控目的基因的表达。不同来源的EPSPS抗草甘膦基因也可由乙醇诱导系统进行调控表达。将诱导系统与抗性基因构建载体并转入植物中,则可以实现抗性基因表达的可控。

全文目录


中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
1 前言  10-20
  1.1 研究背景  10-14
    1.1.1 乙醇诱导系统的研究背景  10-12
    1.1.2 抗草甘膦基因的研究背景  12-14
  1.2 乙醇诱导系统及抗草甘膦作物研究现状  14-18
    1.2.1 乙醇诱导系统  14-15
    1.2.2 抗草甘膦基因及作物研究现状  15-18
  1.3 Cre/loxP、融合PCR及真核与原核生物启动子  18-19
  1.4 本试验研究目的与意义  19-20
2 材料与方法  20-35
  2.1 试验材料  20
  2.2 新型乙醇诱导系统  20-31
    2.2.1 pUC19-alcX(aldA)载体构建  20-24
    2.2.2 alcX(aldA)启动子序列分析  24
    2.2.3 pUC19：alcX(aldA)：Cre载体构建  24-25
    2.2.4 alcX(aldA)在原核生物中表达的鉴定  25-26
    2.2.5 AlcR/alcAmini在原核生物中的表达鉴定  26
    2.2.6 含报告基因GUS的1121-alcX(aldA)载体构建  26-27
    2.2.7 农杆菌感受态细胞GV3101的转化及鉴定  27-28
    2.2.8 农杆菌介导的拟南芥遗传转化  28-29
    2.2.9 拟南芥转化后阳性苗的筛选  29
    2.2.10 含alcX(aldA)转基因植株的鉴定  29-30
    2.2.11 GUS表达的检测  30-31
  2.3 抗草甘膦双元表达载体的构建  31-35
    2.3.1 pYBA400载体的构建  32-33
    2.3.2 1302-EPSP载体的构建  33
    2.3.3 农杆菌介导的拟南芥遗传转化  33
    2.3.4 拟南芥阳性苗的鉴定  33-34
    2.3.5 EPSP表达的鉴定  34
    2.3.6 EPSP的抗性检测  34-35
3. 结果与分析  35-54
  3.1 新型乙醇诱导系统  35-47
    3.1.1 alcX(aldA)启动子的克隆  35-36
    3.1.2 alcX(aldA)启动子序列分析  36
    3.1.3 alcX(aldA)在原核生物中表达的鉴定  36-43
    3.1.4 含报告基因GUS的1121-alcX(aldA)载体构建  43-46
    3.1.5 拟南芥转化后阳性苗的筛选与检测  46-47
    3.1.6 结果和讨论  47
  3.2 抗草甘膦双元表达载体的构建  47-54
    3.2.1 pYBA400载体的构建  47-49
    3.2.2 1302-EPSP载体的构建  49-50
    3.2.3 拟南芥转化及阳性苗的鉴定  50-52
    3.2.4 EPSPS基因系统发育进化树  52-53
    3.2.5 结果与讨论  53-54
4. 结论  54-55
参考文献  55-62
致谢  62-63
附录1  63-64
附录2  64-68
附录3  68-71
作者简介  71

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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