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鸡传染性支气管炎病毒河南地方株分离鉴定及HN104株与HN091株全基因组序列测定

作 者: 刘文杰
导 师: 崔保安;李新生
学 校: 河南农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 传染性支气管炎病毒 全基因组 S1基因 N基因 系统进化树
分类号: S852.65
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病。主要引起鸡支气管、气管、肾脏、输卵管、腺胃、肠道等病变,在饲养环境差的情况下,易引起大肠杆菌、支原体等继发感染而提高鸡群的发病死亡率,导致产蛋鸡的生产性能降低。单一疫苗免疫很容易失败,给世界养禽业带来巨大损失。为此,掌握河南省养鸡业中IBV流行变异株的分子特征有利于IB的检测防控工作。本试验鉴定了2008~2010年自河南开封、新密、许昌、新郑、荥阳等市县分离的7株IBV毒株,代号分别为HN081、HN082、HN091、HN092、HN101、HN102和HN104。将分离株进行9~10日龄SPF鸡胚尿囊腔接种后收集尿囊液进行常规细菌、血凝试验检测阴性后、用RT-PCR方法扩增IBV Sl与N基因。对分离株HN104尿囊液用新配制l%胰酶处理尿囊液后血凝滴度为28,EID50为10-5.5/0.1ml,对NDV在鸡胚增值产生干扰作用,动物回归试验显示:HN104株可致SPF雏鸡出现呼吸道和“花斑肾”症状。通过对4株河南分离株进行S1基因的序列测定,核苷酸同源性在77.4~96.9%,与39株参考IBV同源性为76~100%,并且构建进化树,分离株HN104与HN082为基因I型属于近10多年优势流行致肾病变LX4基因型;HN091为基因III型属于台湾独特TW2296/95型基因型毒株;HN092为基因II型与疫苗株型M41核苷酸同源性高为99%,可能是免疫压力下变异的疫苗株。除HN092外的其它3株分离毒与美国Mass型疫苗株、澳大利亚T株、欧洲4/91株亲缘关系远低于78%。对N基因进化树分析6株分离株中5株属LX4基因型。通过对2009年分离的HN091株和2010年分离的HN104株进行全基因组序列测定和分析,其基因组全长序列和各个基因均表现出与国内分离株较高的相似性。HN091与HN104分离株与已报道的12株全基因代表性毒株的各基因同源性比较分析,发现全基因组中最保守的是非结构基因5b,变异最大是非结构基因3b;5’UTR与病毒起始复制起重要作用非常保守同源性92.0~99.8%。3’UTR变异大同源性59.1~99.5%,3’UTR缺失的大片段可能有利于病毒复制与发转录。HN091分离株是一自然重组株,其S1基因重组于台湾独特基因型TW2575/98型毒株,3a、3b基因重组与广西GX-YL5型毒株,HN091全基因主体于另一河南分离株HN104型毒株同源性高,推断是不同毒株基因重组或点突变的结果。HN104株全基因与2007年四川德阳分离株DY07同源性高达95%;通过对HN104的每个基因与5’UTR与3’UTR进行BLAST检索及系统进化树分析表明HN104株是DY07遗传演化的结果。河南是养禽业大省,地处中原交通便利,也为IB的传播流行提供了前提条件。研究表明,河南省鸡群中IBV存在多种基因型变异病毒,本次试验分离出大多是中国最流行LX4基因型毒株。河南分离株HN104与HN091全基因扩增为进一步研究IBV变异分子机制及为IBV反向遗传操作构建奠定了基础。

全文目录


致谢  4-9摘要  9-10文献综述  10-23  1 禽传染性支气管炎进展  10-12    1.1 病原分类  10    1.2 理化特性  10-11    1.3 生物学特性  11    1.4 宿主系统  11-12  2 IB 的流行病学研究进展  12-16    2.1 IB 不同致病型的研究  12-13    2.2 IB 的流行病学  13-16      2.2.1 国外IB 的流行病学  13-15      2.2.2 国内IB 的流行病学  15-16  3 IB 的检测方法  16-17    3.1 血清学检测  16    3.2 病原学检测  16    3.3 分子生物学检测  16-17  4 IBV 的分子生物学研究  17-23    4.1 IBV 基因组  17    4.2 IBV 的结构蛋白基因与生物学功能  17-19    4.3 IBV 的非结构蛋白基因与生物学功能  19-21    4.4 IBV 51 基因研究进展  21-23      4.4.1 高变区和保守区与抗原决定簇  21-22      4.4.2 血清型  22      4.4.3 毒力与组织嗜性  22-23引言  23-24试验一 河南部分地区鸡传染性支气管炎病毒分离鉴定及分子流行病学研究  24-38  1 材料和方法  24-30    1.1 材料  24-25      1.1.1 主要仪器设备  24      1.1.2 SPF 种蛋及SPF 鸡  24      1.1.3 病料来源及7 株分离株背景  24      1.1.4 主要试剂及配制  24-25      1.1.5 酶和主要试剂  25    1.2 方法  25-30      1.2.1 病料处理与病毒培养  25-26      1.2.2 HA 试验  26      1.2.3 侏儒胚试验  26-27      1.2.4 l%胰酶处理HN104 株鸡胚尿囊液试验  27      1.2.5 HN104 株对NDV-LaSota 株干扰试验  27      1.2.6 HN104 株EID50 测定  27      1.2.7 HN104 株对SPF 鸡的致病力试验  27      1.2.8 RT-PCR 试验  27-29        1.2.8.1 引物的设计与合成  27        1.2.8.2 病毒总RNA 的提取及RT-PCR  27-28        1.2.8.3 第一链cDNA 合成  28        1.2.8.4 基因的PCR 扩增  28-29      1.2.9 基因的克隆与序列测定  29-30        1.2.9.1 PCR 产物的回收与纯化  29        1.2.9.2 PCR 纯化产物与载体的连接  29        1.2.9.3 连接产物转化于感受态细胞  29        1.2.9.4 HN104 株对SPF 鸡的致病力试验  29        1.2.9.5 IBV Sl 序列的测定及序列比较分析  29-30  2 结果与分析  30-36    2.1 侏儒胚试验  30    2.2 胰酶处理HN104 株尿囊液后HA 试验及EID50 测定  30    2.3 HN104 株对NDV 干扰试验  30    2.4 HN104 株对SPF 鸡的致病力试验  30-31    2.5 分离株的Sl 与N 基因核苷酸序列Blast 检索结果  31-32    2.6.S1 基因序列分析及遗传进化分析  32-34      2.6.1 S1 基因序列分析  33      2.6.2 Sl 基因的遗传进化分析  33-34    2.7 N 基因序列分析及遗传进化分析  34-35      2.7.1 N 基因序列分析  35      2.7.2 N 基因遗传进化分析  35    2.8 HN104 株Sl 基因分子特征分析  35-36  3 结论与讨论  36-38试验二 IBV 分离株HN104 与HN091 全基因组序列测定及遗传进化分析  38-53  1 材料与方法  38-42    1.1 材料  38      1.1.1 主要仪器设备  38      1.1.2 酶和主要试剂  38      1.1.3 毒株和SPF 种蛋  38      1.1.4 细胞培养相关试剂的配制  38    1.2 试验方法  38-42      1.2.1 病毒的纯化与增殖  39      1.2.2 分子生物学软件  39      1.2.3 分段扩增IBV 全基因组17 对引物的设计与合成  39      1.2.4 常规分子实验  39        1.2.4.1 病毒基因组RNA 的提取方法  39        1.2.4.2 cDNA 第一链的合成  39        1.2.4.3 基因的克隆与序列测定  39      1.2.5 IBV 全基因组的5’端和3’端扩增  39-41        1.2.5.1 IBV 全基因组的5’端RACE 扩增  39-40        1.2.5.2 IBV 全基因组的3’端RACE 扩增  40-41      1.2.6 IBV 全基因组全长cDNA 序列的测定及序列比较分析  41-42  2 结果与分析  42-50    2.1 RT-PCR 扩增结果  42-43    2.2 基因组cDNA 序列的测定与BLAST 分析  43    2.3 部分分离株IBV 全基因组序列分析  43-46      2.3.1 IBV HN104 株全基因组序列特点  43-44      2.3.2 IBV HN091 株全基因组序列特点  44-45      2.3.3 分离株HN104 和HN091 全基因遗传进化分析  45-46    2.4 分离株HN104 和HN091 的各个编码基因片段序列比较及遗传进化分析  46-50    2.5 5’UTR 与3’UTR 结构基因片段的序列比较及遗传进化分析  50  3 结论讨论  50-53全文总结  53-54参考文献  54-60英文摘要  60-62附录  62-69

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 家畜微生物学(兽医病原微生物学) > 家畜病毒学
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