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减毒沙门氏菌介导TGEV S基因与pIL-6基因双顺反子DNA疫苗的构建与免疫原性研究

作　者: 李春松
导　师: 曹三杰
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪传染性胃肠炎病毒 双启动子载体 S基因 猪白细胞介素6 减毒沙门氏菌 DNA疫苗
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of pigs, TGE)是由冠状病毒科冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)引起的一种猪的呕吐、腹泻和严重脱水为特征的急性、高度接触性传染性肠道疾病,TGEV的疫苗研究是预防该病重要的研究方向,本研究主要进行了减毒沙门氏菌介导TGEV S基因与猪白细胞介素6(pIL-6)基因双顺反子DNA疫苗的构建与免疫原性研究。1. TGEV S基因和pIL-6基因的双顺反子真核表达质粒的构建与鉴定首先,设计TGEV S基因引物和不同酶切位点,以pMD19T-S质粒为TGEV S基因扩增模板,重新构建TGEV S基因的T克隆载体,并将S基因插入双启动子载体真核表达载体pVAXD上的第二个多克隆位点,成功构建了真核表达载体pVAXD-S,对其进行双酶切和PCR鉴定,表明真核载体的TGEV S基因大小为2000bp左右。其次,设计pIL-6引物和不同酶切位点,以pMD19T-IL6为扩增pIL-6基因模板,重新构建了pIL-6基因T克隆载体,然后将pIL-6基因插入构建好的真核表达载体pVAXD-S中并进行鉴定,表明构建的真核表达载体中pIL-6基因大小为500bp左右,成功构建了真核表达载体pVAXD-S-IL6。分别将构建好的2种真核表达载体pVAXD-S-IL6和pVAXD-S通过脂质体转染法转入COS-7细胞中进行真核表达,并分别以RT-PCR和免疫荧光抗体两种种检测方法进行检测。RT-PCR检测真核表达载体pVAXD-S-IL6时,扩增到TGEV S基因2000bp左右和pIL-6基因500bp左右的两条条带,同时对pVAXD-S检测,则可扩增到一条TGEV S基因2000bp左右条带；免疫荧光抗体检测试验结果为pVAXD-S-IL6和pVAXD-S转染孔细胞都能检测到特异性免疫荧光。两种检测结果均证明pVAXD-S-IL6和pVAXD-S在COS-7细胞中得到了良好的表达,为重组沙门氏菌DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。2.减毒沙门氏菌携带TGEV S基因和pIL-6基因DNA疫苗口服免疫的研究重组沙门氏菌构建及鉴定：将构建好的真核表达载体pVAXD-S-IL6和pVAXD-S分别通过电转入法转入减毒沙门氏菌SL7207中,构建重组沙门氏菌SL7207(pVAXD-S-IL6)和SL7207(pVAXD-S),通过对重组菌进行PCR和双酶切鉴定,SL7207(pVAXD-S-IL6)出现2000bp和500bp左右的条带,SL7207(pVAXD-S)检测出2000bp左右条带,证明成功构建了重组沙门氏菌；对该重组沙门氏菌SL7207(pVAXD-S-IL6)进行稳定性试验,证明该菌在含抗生素培养环境下重组菌中的质粒比较稳定;将小鼠随机分成四组,8只/组,分别灌胃接种免疫SL7207(pVAXD-S-IL6)、SL7207(pVAXD-S)、SL7207(pVAXD)和对照组PBS,灌胃后1-2天,部分小鼠出现精神不振,扎堆食欲降低等现象,灌胃一段时间后小鼠恢复,活动正常,说明该菌该浓度对小鼠是安全的。小鼠分组、免疫及采样：将小鼠随机分成四组,16只/组,小鼠共免疫3次,每次间隔两周,分别灌胃接种SL7207(pVAXD-S-IL6)、SL7207(pVAXD-S)、SL7207(pVAXD)三组接种剂量均为1×109CFU,和对照PBS组接种PBS 0.2ml,在免疫前和免疫后2、4、6周,每组分别摘眼采集3只小鼠血清和完整的小肠,在第四次采样前每组随机选取两只小鼠采集脾淋巴细胞进行Y-干扰素检测。检测抗体的抗原制备：以保存菌pET32a-Sbc BL21(DE3)进行复苏鉴定,表达TGEV S蛋白上38KD左右的B、C抗原决定簇位点,将表达的蛋白进行纯化,对表达的蛋白和纯化后的蛋白进行SDS-PAGE,在38KD左右出现特异性条带,证明TGEVS蛋白正确的得到了表达和纯化。最后以表达纯化的蛋白作为包被抗原检测待检血清和肠道样品,样品检测结果：用以检测小鼠特异性TGEV和沙门氏菌IgG、IgA抗体水平,通过检测发现SL7207(pVAXD-S),SL7207(pVAXD-S-IL6)成功激发了TGEV和沙门氏菌抗体(P<0.01)。在第4周SL7207(pVAXD-S-IL6) IgA和IgG抗体水平分别为0.195和0.363,SL7207(pVAXD-S)组IgA和IgG抗体水平分别为0.210和0.402,SL7207(pVAXD-S-IL6)组中抗体均低于SL7207(pVAXD-S)组但无明显差异(P>0.05),但两者抗体水平均显著差异与对照组(P<0.01)；在第6周SL7207(pVAXD-S-IL6) IgA和IgG抗体水平分别为0.253和0.466,SL7207(pVAXD-S) IgA和IgG抗体水平分别为0.210和0.421 SL7207(pVAXD-S-IL6)组两中抗体均高于SL7207(pVAXD-S)组,其中前者IgA抗体极显著差异于后者(P<0.01),IgG抗体则显著差异于后者(P<0.05),与对照组比较均有显著差异(P<0.01)。同时,第6周采集样品前,脾淋巴细胞检测γ-干扰素水平,检测结果显示SL7207(pVAXD-S), SL7207(pVAXD-S-IL6)γ-干扰素浓度(约为1100pg/ml左右)高于SL7207(pVAXD)和PBS免疫组浓度(约为700 pg/ml左右)。

全文目录


中文摘要  3-6
Abstract  6-10
缩写说明  10-12
目录  12-16
第一章 文献综述  16-22
  1. 猪传染性胃肠炎病毒特征和基因结构与功能  16-19
    1.1 TGEV形态学特征  16-17
    1.2 病理变化发病机理  17-18
    1.3 TGEV的分子生物学特征  18-19
      1.3.1 TGEV的基因组成  18
      1.3.2 TGEV的四种结构蛋白  18-19
  2. 减毒沙门氏菌的研究进展  19-20
    2.1 减毒沙门氏菌的入侵机制  19
    2.2 减毒沙门氏菌递呈疫苗的优缺点  19-20
  3. 白细胞介素6对免疫的促进作用  20
  4. 双顺反子系统  20-21
  5. 研究目的和意义  21-22
第二章 TGEV S基因和pIL-6基因的双顺反子真核表达质粒的构建  22-42
  1. 材料  22-23
    1.1 菌株、质粒和细胞  22
    1.2 主要试剂  22
    1.3 试剂配制  22-23
    1.4 主要仪器设备  23
  2. 方法  23-35
    2.1 TGEV S基因T-A克隆载体的构建  23-26
      2.1.1 TGEV S基因特异性引物设计  23-24
      2.1.2 TGEV S基因质粒(pMD19T-S)菌的复苏及其提取  24
      2.1.3 TGEV S基因的PCR扩增  24
      2.1.4 TGEV S基因扩增产物的电泳鉴定  24
      2.1.5 TGEV S基因目的片段凝胶回收与纯化  24
      2.1.6 大肠杆菌(DH5α)感受态细胞的制备  24-25
      2.1.7 TGEV S基因与T载体的连接  25
      2.1.8 连接产物转化DH5 α感受态  25
      2.1.9 TGEV S基因T-A克隆载体鉴定  25-26
    2.2 TGEV S基因真核表达质粒pVAXD-S构建  26-28
      2.2.1 TGEV S基因T-A与真核表达载体pVAXD-S的酶切  26-27
      2.2.2 TGEV S基因与真核表达质粒pVAXD的连接  27
      2.2.3 TGEV S基因真核表达质粒pVAXD-S的鉴定  27-28
    2.3 pIL-6基因T-A克隆载体的构建  28-30
      2.3.1 pIL-6基因特异性引物设计  28
      2.3.2 pIL-6基因保存菌(pMD19T-IL)复苏及提取  28-29
      2.3.3 pIL-6基因的PCR扩增  29
      2.3.4 pIL-6目的片段的凝胶回收与纯化  29
      2.3.5 pIL-6基因与T载体的连接  29-30
      2.3.6 连接产物转化DH5 α感受态细胞  30
      2.3.7 pIL-6基因T-A克隆载体的鉴定  30
    2.4 TGEV S基因真核表达质粒pVAXD-S-IL6的构建  30-32
      2.4.1 真核表达载体pVAXD-S与pIL-6基因T-A克隆载体的酶切  30-31
      2.4.2 pIL-6基因与真核表达质粒pVAXD-S连接  31-32
      2.4.3 真核表达质粒pVAXD-S-IL6的鉴定  32
    2.5 TGEV S基因与pIL-6基因体外表达  32-35
      2.5.1 转染用质粒的提取  32-33
      2.5.2 细胞转染  33-34
      2.5.3 转染细胞RT-PCR检测  34
      2.5.4 间接免疫荧光检测  34-35
  3. 结果与分析  35-39
    3.1 TGEV S基因T-A克隆载体的构建  35-36
      3.1.1 TGEV S基因的PCR扩增  35-36
      3.1.2 TGEV S基因T-A克隆载体鉴定  36
    3.2 TGEV S基因真核表达质粒pVAXD-S的鉴定  36
    3.3 pIL-6基因T-A克隆载体的构建  36-37
      3.3.1 pIL-6基因的PCR扩增  36-37
      3.3.2 pIL-6基因T-A克隆载体的鉴定  37
    3.4 真核表达质粒pVAXD-S-IL6的鉴定  37-38
    3.5 TGEV S基因与pIL-6基因体外表达  38-39
      3.5.1 TGEV S基因与pIL-6基因体外表达RT-PCR检测  38-39
      3.5.2 TGEV S基因真核表达质粒pVAXD-S-IL6的构建  39
  4. 讨论  39-40
  5. 结论  40-42
第三章 减毒沙门氏菌携带TGEV S基因和pIL-6基因DNA疫苗口服免疫研究  42-62
  1. 材料  42-45
    1.1 菌株与质粒  42
    1.2 主要试剂  42
    1.3 试验动物  42
    1.4 试剂配制  42-44
    1.5 主要仪器设备  44-45
  2. 方法  45-51
    2.1 TGEV Sbc蛋白的表达与纯化  45-46
      2.1.1 重组菌pET32a-Sbc BL21(DE3)复苏与鉴定  45
      2.1.2 菌株TGEV Sbc的表达与SDS-PAGE  45
      2.1.3 表达产物TGEV Sbc蛋白的纯化  45-46
    2.2 减毒沙门氏菌SL7207感受态细胞的制备  46-47
    2.3 真核表达质粒电转化进入减毒沙门氏菌SL7207  47
    2.4 重组减毒沙门氏菌的鉴定  47
    2.5 重组减毒沙门氏菌的稳定性试验  47-48
    2.6 重组沙门氏菌对小鼠的免疫安全性试验  48
    2.7 重组沙门氏菌免疫原性试验  48-49
    2.8 免疫小鼠γ-干扰素的检测  49-50
      2.8.1 免疫小鼠脾细胞的制备及蛋白刺激  49-50
      2.8.2 免疫小鼠γ-干扰素的检测  50
    2.9 TGEV特异性血清IgG检测  50-51
    2.10 特异性肠道IgA检测  51
    2.11 减毒沙门氏菌特异性血清IgG检测  51
    2.12 特异性肠道IgA检测  51
  3. 结果与分析  51-60
    3.1 TGEV S_(bc)蛋白的表达与纯化  51-53
      3.1.1 重组质粒pET32a-Sbc PCR与双酶切鉴定  51-52
      3.1.2 TGEV Sbc重组蛋白表达与纯化SDS-PAGE  52-53
    3.2 重组沙门氏菌的构建  53-54
    3.3 重组减毒沙门氏菌的稳定性试验  54
    3.4 重组沙门氏菌对小鼠的免疫安全性试验  54-55
    3.5 免疫小鼠γ-干扰素的检测  55-56
    3.6 TGEV特异性血清IgG检测  56-57
    3.7 TGEV特异性血清肠道IgA检测  57-58
    3.8 减毒沙门氏菌特异性血清IgG检测  58-59
    3.9 减毒沙门氏菌特异性肠道IgA检测  59-60
  4. 讨论  60-61
  5. 结论  61-62
参考文献  62-70
附录(一) 质粒图谱  70-71
附录(二) 基因测序图  71-77
致谢  77-78
作者简介  78

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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