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减毒沙门氏菌介导猪轮状病毒VP7、NSP4基因疫苗的构建及其小鼠免疫试验研究

作　者: 熊俊
导　师: 曹三杰；文心田
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪轮状病毒 DNA疫苗 减毒沙门氏菌 VP7 NSP4 X455O
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


猪轮状病毒感染是一种猪的急性肠道传染病,造成仔猪严重腹泻和脱水,仔猪病死率高,给养猪业带来巨大损失。新型稳定、安全、高效的疫苗研究是防控该病的重要方向。本研究进行了以减毒鼠伤寒沙门氏菌为运送载体的猪轮状病毒VP7和NSP4基因疫苗的构建及其小鼠免疫试验研究。1、猪轮状病毒VP7、NSP4基因的克隆及鉴定根据基因库中猪轮状病毒OSU株基因序列,分别设计一对引物,通过RT-PCR成功扩增VP7的全序列(1062 bp)和NSP4基因的259-525位核苷酸序列(267 bp),并分别进行TA克隆。序列比对结果表明,扩增得到的VP7和NSP4序列与标准序列基本相同。2、猪轮状病毒VP7、NSP4基因的原核表达及其免疫血清的制备分别从T载体上酶切回收上述克隆及鉴定正确的猪轮状病毒VP7、NSP4基因,连接原核表达载体,构建了含有重组质粒pET28a-VP7和pET32a-NSP4的BL21表达菌。经IPTG诱导后,重组菌分别表达出约30 KDa和28 KDa的融合蛋白。纯化后的融合蛋白分别免疫家兔,制备得到了抗融合蛋白的血清。经检测,制备的两种血清中分别含有较高水平的抗融合蛋白VP7、NSP4的特异IgG抗体。3、介导猪轮状病毒VP7、NSP4基因的重组减毒沙门氏菌的构建利用平衡致死系统改造真核表达载体质粒pVAX1和pVAXD,将Kan抗性基因替换为asd基因,再将NSP4及VP7基因片段分别插入单表达的真核表达载体pVAX1-asd中,并一同插入双表达载体pVAXD-asd中,分别构建为含有VP7和NSP4基因的单表达质粒和双表达质粒,并将重组质粒分别电转化沙门氏菌χ3730,再从中提取质粒电转化减毒沙门氏菌χ4550。重组菌分别经菌落PCR鉴定,均能扩增出与目的基因大小基本相同的片段；提取质粒分别经酶切鉴定,均能酶切出与目的基因和载体片段大小基本相同的片段,表明重组减毒沙门氏菌均构建成功。4、介导猪轮状病毒VP7、NSP4基因的重组减毒沙门氏菌的生物学特性鉴定及其小鼠免疫试验分别提取减毒沙门氏菌重组质粒转染COS-7细胞,分别以制备的免疫血清为抗体血清,进行间接免疫荧光试验,均能观测到荧光现象,表明重组质粒能在COS-7细胞中表达。在无抗性生长条件下,重组减毒沙门氏菌的质粒稳定性良好。重组减毒沙门氏菌口服免疫小鼠,第3天能在回肠末端组织中检测到有目的基因转录的RNA,间接ELISA检测小鼠血清特异性抗体IgG和肠道黏膜特异性抗体IgA,结果显示双表达质粒组和混合质粒组诱导小鼠产生的血清特异抗体IgG和肠道黏膜抗体IgA水平高于单表达质粒组。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
符号说明  8-11
第一部分 文献综述  11-20
  1 猪轮状病毒病概述  12-14
    1.1 猪轮状病毒病的历史  12
    1.2 猪轮状病毒病的流行病学  12
    1.3 猪轮状病毒病的临床症状  12-13
    1.4 猪轮状病毒病的理化特性  13
    1.5 猪轮状病毒病的分子结构及功能  13-14
    1.6 猪轮状病毒病的分型  14
  2 轮状病毒诊断概述  14-15
    2.1 临床诊断  14
    2.2 电镜观察诊断  14-15
    2.3 ELISA诊断  15
  3 猪轮状病毒疫苗概况  15-17
    3.1 传统疫苗  15-16
    3.2 亚单位疫苗  16
    3.3 DNA疫苗  16-17
  4 以沙门氏菌为载体的口服DNA疫苗研究进展  17-19
    4.1 沙门氏菌的基因缺失减毒  17
    4.2 aro(aroA、aroC、aroD)基因缺失  17-18
    4.3 asd基因缺失  18
    4.4 携带DNA疫苗的减毒沙门氏菌作为运送载体  18-19
  5 本研究目的及意义  19-20
第二部分 材料与方法  20-52
  1 试验材料  20
    1.1 生物材料  20
    1.2 主要试剂  20
  2 主要仪器  20-21
  3 方法  21-52
    3.1 PRV VP7、NSP4基因的克隆及鉴定  21-25
    3.2 PRV VP7蛋白原核表达及纯化  25-32
    3.3 PRV NSP4蛋白原核表达及纯化  32-35
    3.4 兔抗PRV VP7、NSP4蛋白免疫血清的制备  35-36
    3.5 PRV VP7、NSP4基因真核表达质粒的构建及鉴定  36-46
    3.6 重组沙门氏菌的构建及部分生物学性质鉴定  46-49
    3.7 重组沙门氏菌小鼠免疫试验  49-52
第三部分 结果与分析  52-75
  1 PRV VP7和NSP4基因的克隆鉴定及分析结果  52-53
    1.1 VP7基因的克隆及序列分析结果  52
    1.2 NSP4基因的克隆及序列分析结果  52-53
  2 PRV VP7和NSP4蛋白表达及抗血清的制备结果  53-59
    2.1 VP7基因原核表达质粒的构建及VP7蛋白表达结果  53-56
    2.2 NSP4基因原核表达质粒的构建及NSP4蛋白表达结果  56-58
    2.3 兔抗NSP4和VP7蛋白特异性IgG抗体水平ELISA检测结果  58-59
  3 构建PRV VP7和NSP4基因真核表达质粒的鉴定结果  59-63
    3.1 真核表达载体质粒质粒pVAX1-asd、pVAXD-asd的菌落PCR鉴定结果  59
    3.2 真核表达载体质粒pVAX1-asd、pVAXD-asd的测序结果  59-60
    3.3 重组真核表达质粒pVAX1-asd-NSP4、pVAX1-asd-VP7、pVAXD-asd-NSP4-VP7的菌落PCR鉴定结果  60-61
    3.4 重组真核表达质粒pVAX1-asd-NSP4、pVAX1-asd-VP7、pVAXD-asd-NSP4-VP7的酶切鉴定结果  61-63
  4 重组真核表达质粒电转化减毒沙门氏菌的鉴定结果  63-66
    4.1 重组真核表达质粒电转化减毒沙门氏菌的菌落PCR鉴定结果  63-65
    4.2 重组真核表达质粒电转化减毒沙门氏菌的酶切鉴定结果  65-66
  5 重组沙门氏菌生物学特性试验结果  66-69
    5.1 重组真核表达质粒转染COS-7的间接免疫荧光试验结果  66-68
    5.2 重组菌χ4550(pVAXD-asd-NSP4-VP7)无抗生素条件下质粒稳定性试验  68
    5.3 重组沙门氏菌体内感染小鼠后RT-PCR检测VP7及NSP4基因的转录结果  68-69
    5.4 重组菌感染小鼠的安全性试验  69
  6 重组沙门氏菌小鼠免疫试验结果  69-75
    6.1 ELISA检测小鼠血清样本IgG抗体水平结果  69-71
    6.2 ELISA检测小鼠肠道样本IgA抗体水平结果  71-73
    6.3 免疫小鼠γ-干扰素的检测结果  73-75
第四部分 讨论  75-79
  1 VP7及NSP4基因克隆的分析  75
  2 VP7和NSP4蛋白原核表达区域的选择  75-76
  3 原核表达VP7及NSP4蛋白及制备抗体血清及对于后续试验的意义  76
  4 真核表达载体的选择及改造  76-77
  5 重组减毒沙门氏菌免疫的特点  77
  6 NSP4基因对于增强机体体液和黏膜免疫应答作用探讨  77-79
第五部分 结论  79-80
参考文献  80-84
致谢  84-85
附录  85-88

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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