学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

慢病毒介导的Bcl-2基因RNAi联合TRAIL基因共表达对淋巴瘤细胞生长作用研究

作　者: 张旭东
导　师: 张明智
学　校: 郑州大学
专　业: 中西医结合临床肿瘤学
关键词: Bcl-2 TRAIL 共表达 慢病毒 RNA干扰 淋巴瘤 基因治疗
分类号: R733.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 162次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing legand, TRAIL)是近年发现的具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡而对『正常细胞没有毒性的肿瘤坏死因子家族成员。TRAIL可与胞膜死亡受体DR4、DR5结合来激活死亡受体通路,继而通过线粒体通路和非线粒体通路引起肿瘤细胞凋亡。以TRAIL为基础的肿瘤治疗策略已应用于临床试验,越来越多证据表明TRAIL在肿瘤治疗方面具有很大潜力和诸多优势。但单独应用TRAIL治疗血液系统肿瘤存在一定局限性,因为在血液系统恶性肿瘤中,常常因P53基因突变和B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2, Bcl-2)基因的高表达等因素,导致肿瘤细胞对TRAIL敏感性下降,并诱导血液系统恶性肿瘤对TRAIL的耐药。Bcl-2基因最初是在非霍奇金滤泡状B细胞淋巴瘤中分离出来的,是Bcl-2家族蛋白成员中主要的抗凋亡分子,主要分布在淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、肠癌、前列腺癌、白血病等恶性肿瘤中,通过与Bcl-2家族的促凋亡蛋白形成异源二聚体,维持促凋亡成员在细胞内的定位分布,保护细胞不进入凋亡程序。我们猜想TRAIL的高表达和Bcl-2低表达可能对于抑制肿瘤细胞生长具有协同作用。首先,TRAIL和Bcl-2在肿瘤细胞凋亡途径的机制不同,TRAIL能够结合细胞表面的死亡受体,激活外源性途径进而激活Caspase-8,剪切BH3结构域凋亡诱导蛋白(Bcl-2homology3interacting domain death protein, BID),增强线粒体途径细胞凋亡信号；Bcl-2蛋白导致线粒体膜电位的丢失和通透性增加,从而引起细胞凋亡。另外,许多研究已经证明肿瘤细胞对化疗药物和放疗的耐药性与Bcl-2高表达有关,同时,Bcl-2的表达下调可以增加肿瘤细胞对药物凋亡诱导的敏感性。近年来慢病毒载体己成为转基因操作中重要的工具,它具有转移基因容量大、转导效率高以及可将外源基因整合至靶细胞基因组实现外源基因持续稳定表达等特点,已被广泛应用于包括淋巴瘤在内的多种肿瘤的研究。因此,本课题利用慢病毒载体和RNAi技术,构建了同时高表达外源基因和shRNA表达盒的重组慢病毒载体,实现了对TRAIL和Bcl-2基因的同步调控；同时还评价了所构建的重组慢病毒系统感染不同来源(NK细胞、B细胞和T细胞)淋巴瘤细胞的效率,鉴定了对TRAIL和Bcl-2基因的调控能力。通过对淋巴瘤细胞生长抑制、凋亡诱导作用以及旁观者效应的研究,深入探讨了TRAIL和Bcl-2基因对淋巴瘤细胞的生长作用以及协同抗肿瘤效应,探索了淋巴瘤治疗新模式。实验目的：构建共表达Bcl-2-shRNA和TRAIL基因的慢病毒载体系统,评价重组慢病毒系统对不同来源淋巴瘤细胞的感染效率,鉴定此重组慢病毒系统下调Bcl-2基因和上调TRAIL基因表达的功能。研究慢病毒介导的Bcl-2基因RNAi联合TRAIL基因表达对于淋巴瘤细胞生长抑制、凋亡诱导作用,评价Bcl-2基因表达下调和TRAIL表达上调抗淋巴瘤生长的协同效应,探索携带TRAIL基因和Bcl-2shRNA的重组慢病毒对淋巴瘤细胞的旁观者效应。主要内容：第一部分：慢病毒表达载体pWPI-trail/bcl-2-shRNA的构建方法：1.将bcl-2-shRNA寡核苷酸片段退火,产物插入pLL3.7慢病毒表达载体mU6启动子下游,筛选阳性菌落,构建pll-bcl-2-shRNA慢病毒表达载体。2.提取人胎盘组织总RNA, RT-PCR扩增TRAIL cDNA,克隆至pGM-T克隆载体,筛选阳性菌落,酶切及测序鉴定pGM-T-trail的构建；将TRAIL基因从pGM-T-trail克隆载体上切下,并克隆至pWPI慢病毒表达载体EF-1α启动子下游(IRES-GFP上游),筛选阳性菌落,构建pWPI-trail慢病毒表达载体。3.从pll-bcl-2-shRNA质粒上获取mU6/bcl-2-shRNA表达盒,克隆至pWPI-trail质粒EFl-α启动子上游,筛选阳性菌落,构建pWPI-trail/bcl-2-shRNA慢病毒表达载体。结果：1.酶切鉴定及测序显示pll-bcl-2-shRNA慢病毒表达载体构建成功。2.酶切鉴定及测序显示pGM-T-trail构建成功；酶切鉴定显示pWPI-trail慢病毒表达载体构建成功。3.酶切鉴定显示pWPI-trail/bcl-2-shRNA慢病毒表达载体构建成功。第二部分：重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA的制备和感染淋巴瘤细胞效率测定方法：1.使用pWPI (pLL3.7)/vsvg/δ8.0慢病毒包装系统,在293T细胞中包装慢病毒lenti-bcl-2-shRNA> lenti-trail和lenti-trail/bcl-2-shRNA,??将粗提液用超速离心法浓缩纯化；利用绿色荧光蛋白(GFP)表达测定慢病毒滴度。2.利用荧光计数和流式细胞仪测定重组慢病毒lenti-bcl-2-shRNA. lenti-trail和lenti-trail/bcl-2-shRNA对不同淋巴瘤细胞(人滤泡B淋巴瘤细胞系DOHH2,人T细胞淋巴瘤细胞系Jurkat和人NK细胞淋巴瘤细胞系YTS)的感染效率,评价不同淋巴瘤细胞株对慢病毒的敏感性。结果：1.成功包装出三种重组慢病毒lenti-bcl-2-shRNA、lenti-trail和lenti-trail/bcl-2-shRNA,纯化浓缩后的滴度可达109IFU/ml。2.重组慢病毒lenti-bcl-shRNA、lenti-trail和lenti-trail/Mcl-2-shRNA可有效感染淋巴瘤细胞株,感染滴度较小时(MOI≤10),重组慢病毒对不同淋巴瘤细胞感染效率无明显差别(P>0.05),但在感染滴度较大时(MOI>10),重组慢病毒对YTS细胞的感染效率较其他两种细胞高(P<0.05),但对于三种淋巴瘤细胞,重组慢病毒的感染效率最终进入平台期,部分淋巴瘤细胞始终不能被有效感染。第三部分：重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA功能测定和抗淋巴瘤生长作用研究方法：1.重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA感染淋巴瘤细胞(人滤泡B淋巴瘤细胞系D0HH2,人T细胞淋巴瘤细胞系Jurkat??口人NK细胞淋巴瘤细胞系YTS), RT-PCR测定Bcl-2和TRAIL mRNA表达情况,Western blot测定Bcl-2和TRAIL蛋白表达情况。2.MTT法测定重组慢病毒lenti-bcl-2-shRNA、lenti-trail和lenti-trail/bcl-2-shRNA对于不同淋巴瘤细胞的生长抑制作用,评价bcl-2-shRNA和TRAIL的协同抗淋巴瘤生长作用。3.采用Flow cytometry (FCM)检测重组慢病毒lenti-bcl-shRNA、lenti-trail和lenti-trail/bcl-2-shRNA对人淋巴瘤细胞周期和凋亡率的影响；评价重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA对淋巴瘤细胞的旁观者效应。结果：1. lenti-trail/bcl-2-shRNA可以同时有效抑制Bcl-2基因表达和上调TRAIL基因的表达。2.重组慢病毒lenti-bcl-2-sh.RNA、lenti-trail和lenti-trail/bcl-2-shRNA可以有效抑制不同来源淋巴瘤细胞的增殖,诱导其凋亡,从而有效抑制淋巴瘤细胞的生长,其中以lenti-trail/bcl-2-shRNA的抗淋巴瘤作用最明显,表明bcl-2的下调和TRAIL的上调具有很好的协同抗淋巴瘤生长作用。3.重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA感染不同来源淋巴瘤细胞后可以产生明显的旁观者效应,即效应细胞和旁观细胞同时被抑制增殖和诱导凋亡,提示lenti-trail/bcl-2-shRNA有可能成为联合化疗药物以及其他抗肿瘤药物的理想基因药物。结论：1.成功构建同时携带TRAIL基因和bcl-2-shRNA的慢病毒表达载体pWPI-trail/bcl-2-shRNA,并可作为构建携带双靶点和报告基因的慢病毒载体平台。2.成功制备高滴度的重组慢病毒eiti-trail/bcl-2-shRN A,可以不同程度的有效感染不同来源的淋巴瘤细胞。3.重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA的可以显著提高淋巴瘤细胞中TRAIL基因的表达和抑制Bcl-2基因的表达,且具有良好的协同作用,从而有效抑制淋巴瘤细胞的生长。4.重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA感染不同来源淋巴瘤细胞后可以产生明显的旁观者效应。

全文目录


摘要  4-9
Abstract  9-16
英文縮略词表  16-17
引言  17-20
第一章：慢病毒表达载体pWPI-trail/bcl-2-shRNA的构建  20-51
  前言  20-22
  材料与方法  22-39
    1 实验材料  22-25
    2 实验方法  25-39
  结果  39-48
    1 pLL-bcl-2-shRNA慢病毒载体质粒的构建和鉴定  39-41
    2 pWPI-TRAIL慢病毒表达载体的构建和鉴定  41-45
    3 pWPI-trail/bcl-2-shRNA慢病毒表达载体的构建和鉴定  45-48
  讨论  48-50
  小结  50-51
第二章：重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA的制备和感染淋巴瘤细胞效率测定  51-64
  前言  51-52
  材料与方法  52-57
    1 实验材料  52-53
    2 实验方法  53-57
  结果  57-61
    1 重组慢病毒的包装  57
    2 重组慢病毒的制备和滴度测定  57-59
    3 重组慢病毒感染淋巴瘤效率测定  59-61
  讨论  61-63
  小结  63-64
第三章：重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA功能测定和体外抗淋巴瘤生长作用研究  64-96
  前言  64-66
  材料与方法  66-77
    1 主要材料  66-69
    2 主要方法  69-77
  结果  77-93
    1 重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA功能鉴定  77-85
    2 重组慢病毒对淋巴瘤细胞的生长抑制作用研究  85-93
  讨论  93-95
  小结  95-96
结论  96-97
参考文献  97-103
综述  103-118
  一、凋亡通路  104-106
  二、表面抗原  106-108
  三、癌基因通路  108-110
  四、其他信号传导通路  110-113
  参考文献  113-118
致谢  118-119
个人简历及在学期间发表的学术论文  119
  个人简历  119
  在学期间发表的学术论文  119

相似论文

  1. FGF8在人和小鼠牙齿中亚型分析及其对牙齿发育的影响,Q954.48
  2. CADPE抗肿瘤作用及对胃癌细胞凋亡的影响,R735.2
  3. 聚乙烯亚胺修饰糖脂共聚物介导基因治疗研究,R450
  4. 甜菜夜蛾信息素结合蛋白的表达动态及其受交配和钟基因沉默的影响,S433.4
  5. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
  6. 利用慢病毒载体制备转基因小鼠和牛胚胎的研究,S814.8
  7. 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF1和ORF7 shRNA重组慢病毒的构建与鉴定,S852.65
  8. 马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因的克隆、表达分析及其dsRNA的发酵生产,S435.32
  9. 几种新型杀虫剂对马铃薯甲虫的毒力及两类靶标的分子克隆,S435.32
  10. 靶向奶山羊BLG的慢病毒RNAi表达载体的构建及转基因细胞系的建立,S827
  11. 慢病毒载体介导的RNAi特异性沉默猪Myostatin基因的研究,S828
  12. GATA2与Smad4相互作用对TGFβ信号通路负调控的初步研究,R363
  13. 新型非病毒基因转染体系的构建及其在骨髓间充质干细胞基因重组中的应用,R346
  14. MCFP对肝癌细胞生物行为学影响初步研究,R735.7
  15. 弥漫大B细胞淋巴瘤患者外周血T淋巴细胞亚群与NK细胞检测的临床意义,R733.1
  16. 灰飞虱功能基因的克隆及其RNAi致死效应,S435.112.3
  17. sCD40L对白血病HL-60细胞株生物学行为的影响及机制,R733.7
  18. 原发性乳腺恶性淋巴瘤临床分析,R737.9
  19. RNA干扰抑制ERCC1对非小细胞肺癌化疗敏感性的影响（体外实验）,R734.2
  20. 蟾蜍灵对血管内皮细胞EAhy926增殖和诱导凋亡的研究,R285
  21. 大承气汤对多器官功能障碍综合征大鼠小肠平滑肌细胞Bcl-2和Bax表达的影响,R285.5

中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 网状内皮系统肿瘤
© 2012 www.xueweilunwen.com