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耐碳青霉烯G-杆菌碳青霉烯酶基因、整合子和ISCR1结构特征及基因分型研究

作　者: 孙静静
导　师: 芮勇宇
学　校: 南方医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: NDM KPC ISCR 整合子 ERIC MLST
分类号: R44
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景与目的近年来由于抗生素的广泛应用,细菌在抗生素的选择压力下耐药率不断提高,耐碳青霉烯G-杆菌的分离率也逐年升高。耐碳青霉烯细菌是对亚胺培南或者美洛培南抗菌药物耐药的细菌。革兰阴性(G-)杆菌是引起临床感染最常见的细菌,主要包括肠杆菌科(常见大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属)和非发酵革兰阴性杆菌(常见铜绿假单胞菌、不动杆菌属)。细菌对碳青霉烯耐药性不断上升和快速传播已成为临床感染治疗面临的重要难题,其耐药机制研究已成为微生物领域关注的热点。导致细菌产生耐碳青霉烯的机制有很多种,其中耐药基因水平转移是细菌耐药性迅速产生及扩散的主要原因之一。耐药基因位于质粒、转座子、整合子或插入序列共同区(ISCR)等可水平转移的基因元件上,通过接合、转化、转导、转座等方式在不同菌株间水平传播。研究临床G-杆菌泛耐药菌的耐药机制,可以指导临床合理使用抗生素,为新型抗生素的研发提供理论基础,为预防传播提供依据。目前国内外可水平转移的耐药基因元件的研究,主要集中在可水平转移的碳青霉烯酶基因家族、可携带多种耐药基因盒的整合子、可携带多种耐药基因盒且传播能力更强的插入序列共同区(ISCR1)的研究。碳青霉烯酶是指能够明显水解至少亚胺培南或美罗培南的一类β内酰胺酶,包括Ambler分子结构分类的A、B、D三类酶。其中B类为金属β内酰胺酶,简称金属酶,属于Bush分类中的第3组,按来源可分为天然金属酶和获得性金属酶,前者由染色体编码,后者多由质粒编码,主要见于铜绿假单胞菌、不动杆菌属和肠杆菌科细菌。A、D类为丝氨酸酶,分别属于Bush分类中的第2f和2d亚组,A类酶主要见于肠杆菌科细菌,D类酶(OXA型酶)主要见于不动杆菌属。由产碳青霉烯酶菌株感染造成的暴发流行,有时使治疗陷入无药可用的境地,给临床抗感染治疗带来极大地挑战。以往一直以耐碳青霉烯类抗生素非发酵革兰阴性杆菌感染的报道为主,近几年世界各地均报道出现耐碳青霉烯抗生素的肠杆菌科细菌,尤其在肠杆菌科细菌中发现携带新德里Ⅰ型金属p内酰胺酶(NDM-1)、KPC的菌株而备受关注。整合子可通过对基因盒的捕获和剪切使基因盒发生移动,自身可位于转座子、质粒等可移动基因元件上使整合子发生移动。整合子是细菌特别是革兰阴性菌基因中,一种能识别且俘获移动性基因盒,并有位点特异性的重组表达系统。整合子本身无法移动,但常出现在转座子、接合性质粒、噬菌体或细菌染色体上,共同做为自身移动的载体,捕获和整合耐药基因,形成巨大的多基因座,并随细菌的繁殖复制到子代DNA中。典型的整合子结构由3部分组成：5’保守区(5’conserved segment,5’CS)、3’保守区(3’conserved segment,3’CS)和两者之间的可变区(variable region)。整合子5’保守区包括编码整合酶(integrase, IntI)的基因(intI)、整合子重组位点attl和整合子可变区启动子(Pant)。其中Pant位于IntI1的编码框内,有的整合子还有启动子P2。整合子常根据intI基因序列进行分类,目前已被分为10类,1类整合子最常见,从临床菌株中发现的整合子大多属于此类。整合子可变区带有不同数量的基因盒,大部分是编码各种抗生素抗性的耐药基因盒。1类整合子的3保守区包括3个开放阅读框(ORF)：磺胺耐药基因(sull),季铵盐化合物及溴乙锭的耐受基因(qacEΔ1)及功能不明的ORF5。ISCR是由" insertion sequences "(ISs)和" commmon regions "(CRs)得来。它既可具有插入序列的特点,也具有共同区的特点。IS属于高度可移动性转座因子,对基因组一个或多个靶位点具有插入能力的小分子片段,并常可以移动邻近的基因。ISCR是一类IS91-like因子家族的成员,缺少反向重复序列,通过滚环方式转移邻近的耐药基因。ISCR成员中ISCR1研究最为广泛,它常出现在复杂性Ⅰ类整合子。ISCR1介导一系列的转座事件发生,转座不同长度的耐药基因,如catA2、dfrA、qnr、blaCTX-M、blacMY。ISCR1常连同耐药基因插入到普通的一类整合子的3’保守末端,介导形成复杂的一类整合子,如1n6和In7。另外,环状形式的ISCR1因子连同耐药基因直接插入到带有一个ISCR1拷贝的整合子3’保守末端,介导形成带有两个拷贝ISCR1因子的复杂的整合子,这些会导致菌株的耐药播散性更强。目前耐碳青霉烯G-杆菌的传播机制研究也越来越受到关注,对医院各科室各类标本分离细菌种类及耐药性进行分析,可利用世界卫生组织网站免费提供的WHONET软件分析,如发现泛耐药G-杆菌的暴发或流行,则需及时进行传播机制等流行病学研究。首先进行个案调查,查阅病案等资料。再收集保存患者及可能传播来源分离的菌株,进行基因分型等分子流行病学研究。目前国内外应用最广泛的基因分型方法主要包括脉冲场凝胶电泳方法(PFGE)、随机引物PCR分型(ERIC-PCR)、多位点基因测序分型(MLST)。如果主要用于调查某次暴发或流行,则可选用PFGE和ERIC-PCR,如果主要用于与国内外其他学者报道的结果进行比较,则最好选用MLST。本课题针对临床分离的耐碳青霉烯G-杆菌进行常见碳青霉烯酶基因检测,重点对NDM、KPC基因阳性菌株进行分析；对临床分离的耐碳青霉烯铜绿假单胞菌、不动杆菌属进行Ⅰ类整合子和ISCR1相关耐药基因进行检测,从而了解Ⅰ类整合子和ISCR1的携带耐药基因的分布特征；对临床分离的铜绿假单胞菌、不动杆菌属,建立ERIC-PCR基因分型方法,进行分子流行病学研究。已经针对携带KPC基因的超级细菌建立了多位点基因序列分型(MLST)方法,阐明这些菌株的分子遗传学特征。研究方法1.菌株的选取和基因组DNA提取收集南方医科大学南方医院检验科微生物室2009年6月至2011年6月临床分离的耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科、不动杆菌、铜绿假单胞菌,主要分离自痰液、尿液、分泌物、血液等各类标本。用SDS裂解,蛋白酶K消化,酚-氯仿提取,醋酸钠-乙醇沉淀的方法提取细菌的全基因组DNA。2.碳青霉烯酶基因检测及水平传播机制研究聚合酶链式反应(PCR)检测常见碳青霉烯酶基因(NDM、KPC、VIM、IMP、SPM、GIM、OXA),对PCR阳性产物进行序列测定以确定基因亚型,并重点对携带NDM或KPC的阳性菌株进一步扩增核糖体基因及间隔区序列并测序,以保证属种鉴定的准确,对携带NDM或KPC的阳性菌株做接合转移试验检测NDM、KPC耐药基因是否位于接合性质粒上及对耐药表型的影响。3.Ⅰ类整合子、ISCR1及复杂性整合子结构研究分别扩增Ⅰ类整合子ISCR1保守区和可变区,然后利用限制性内切酶HintⅠ和RsaⅠ酶切可变区,对酶切产物进行初步分类,挑选酶切不同类型测序,分析同源性和耐药基因盒组合。对同时携带整合子和ISCR1的菌株扩增其串联区,通过测序得到复杂性整合子结构。4.基因分型研究针对携带KPC基因的超级细菌进行了多位点基因序列分型(MLST),对临床分离的耐碳青霉烯类抗生素的铜绿假单胞菌、不动杆菌属,建立ERIC-PCR基因分型方法,进行分子流行病学研究。研究结果1.碳青霉烯酶基因的检出情况共检出9株肺炎克雷伯菌、159株铜绿假单胞菌、201株不动杆菌属对亚胺培南或美洛培南耐药的菌株。273株菌检测出携带碳青霉烯酶基因：1株不动杆菌属genomosp.3种、1株13TU种携带金属酶NDM-1基因(国际首次),9株肺炎克雷伯菌携带KPC-2型碳青霉烯酶基因,31株铜绿假单胞菌携带IMP-1基因,15株铜绿假单胞菌携带IMP-9基因,1株铜绿假单胞菌携带IMP-25基因,16株铜绿假单胞菌携带VIM-2基因,180株不动杆菌携带OXA-23基因,148株不动杆菌携带OXA-51基因,其中135株同时携带OXA-23和OXA-51基因,8株不动杆菌携带OXA-58基因。其中NDM和KPC基因均位于接合性质粒上。2.检测到239株细菌携带Ⅰ类整合酶,165株细菌携带基因盒9株肺炎克雷伯菌均携带dfrA25;在201株不动杆菌中,115株aacA4+calBS+aadA1,4株aacC1+orfP+orfQ+aadA1,2株arr3+aacA4,;在240株铜绿假单胞菌中,15株blaIMP-9+aacA4-blaOXA-10+aadA2,7株aac(6)-Ⅱ+aadA13+cmlA8+blaOXA-10a,6株aadB+blctPSE-1,3株aacA4+blaIMP+blaOXA-30+catB3,2株dfrA12+orfF+aadA2,1株aadA2+aacA4,1株携带aadB+aadA2-, dfrA15两个整合子。3.检测到121株细菌ISCR1保守区阳性,23株ISCR1可变区阳性9株肺炎克雷伯菌中ISCR1均为阴性。在201不动杆菌属中,102株orf513阳性,其中69株ISCR1+qnrA1+ampR+qacEA1,21株ISCRl+WaPER-1+GST+ABC transporter+gacEΔl;在159株铜绿假单胞菌中,19株orf513阳性,2株ISCR1+qnrA\+ampR+qacEΔl。4.复杂性整合子结构研究发现在同一株铜绿假单胞菌中同时携带两个复杂性整合子,结构分别为：intl1+dfr A15+qacdelsul+ISCRl+qnrA1+ampR+qacdelsul; intl1+aadB+aadA2+qacdelsul+lSCRl+qnrA1+ampR+qacdelsul。5. ERIC-PCR结果显示：本院2009年6月-2011年6月分离的耐碳青霉烯铜绿假单胞菌、不动杆菌均为散发,不动杆菌有优势克隆株。9株肺炎克雷伯菌株MLST分型均为ST11。结论1.国际首次在不动杆菌属genomosp.3种、13TU种发现金属酶NDM-1基因(均经测序验证),且均位于接合性质粒上。在9株耐碳青霉烯抗生素的肺炎型肺炎克雷伯菌株中,检测到9株均携带KPC-2基因,均位于接合性质粒上,说明本院的肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯主要是由KPC-2基因引起的。耐碳青霉烯抗生素的不动杆菌属主要是由携带OXA基因引起的。铜绿假单胞菌耐碳青霉烯的部分原因是由于携带IMP基因或者VIM基因。2.本院临床分离的泛耐药G-杆菌Ⅰ类整合酶的携带率为64.8%,基因盒的携带率为41.5%,耐药基因主要是耐氨基糖苷类、甲氧苄啶类、氯霉素类、β-内酰胺酶类。3.本院临床分离的泛耐药G-杆菌ISCR1转座酶的携带率为32.8%,在ISCR1阳性菌株中,ISCR1携带耐药基因比例为19.0%。携带的耐药基因主要是qnrA1。4.首次报道在一株铜绿假单胞菌中同时携带两个复杂性整合子：intI1+dfrA15+qacdelsul+ISCRl+qnrA1+ampR+qacdelsul; intI1+aadB+aadA2+qacdelsul+ISCR1+qnrA1+ampR+qacdelsul。5.本院的耐碳青霉烯类菌株均为散发,其中不动杆菌有明显的优势克隆株,应加强检测,防止该优势克隆菌株的发生及播散,预防医院感染的发生

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-17
前言  17-23
第一部分碳青霉烯酶基因研究  23-41
  1.1 材料  23-25
  1.2 方法  25-29
  1.3 结果  29-38
  1.4 讨论  38-41
第二部分 Ⅰ类整合子、ISCR1及复杂性整合子结构特征研究  41-53
  2.1 材料  41-42
  2.2 方法  42-45
  2.3 结果  45-49
  2.4 讨论  49-53
第三部分基因分型研究  53-59
  3.1 材料  53
  3.2 方法  53-55
  3.3 结果  55-57
  3.4 讨论  57-59
全文总结  59-61
参考文献  61-70
缩略语词汇表  70-71
硕士期间完成和发表论文情况  71-72
致谢  72-74
统计学证明  74

耐碳青霉烯G-杆菌碳青霉烯酶基因、整合子和ISCR1结构特征及基因分型研究

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