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临床分离非发酵G-杆菌Ⅰ类整合子及ISCR1的结构研究

作　者: 吴奎海
导　师: 芮勇宇
学　校: 南方医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 非发酵革兰阴性杆菌 ISCR 整合子耐药基因
分类号: R440
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景与目的近年来由于抗生素的广泛应用,细菌的耐药问题日趋严重。细菌对抗生素耐药性不断上升和快速传播已成为临床感染治疗面临的重要难题,其耐药机制研究已成为微生物领域关注的热点。细菌的耐药机制复杂,包括药物作用靶位的改变、渗透性的改变、产生灭活酶和钝化酶、排除系统以及形成生物膜,其中细菌通过基因的水平转移,获得外源性耐药基因是加快临床耐药菌株产生的重要原因。耐药基因可以通过接合、转化、转导、转座等方式在不同细菌间传播。与细菌耐药基因水平转移密切相关的遗传结构有接合性质粒、转座子、整合型噬菌体、整合子和插入序列共同区(ISCR)。整合子可通过对基因盒的捕获和剪切使基因盒发生移动,自身可位于转座子、质粒等可移动基因元件上使整合子发生移动。整合子是细菌特别是革兰阴性菌基因中,一种能识别且俘获移动性基因盒,并有位点特异性的重组表达系统。整合子本身无法移动,但常出现在转座子、接合性质粒、噬菌体或细菌染色体上,共同做为自身移动的载体,捕获和整合耐药基因,形成巨大的多基因座,并随细菌的繁殖复制到子代DNA中。自从整合子—基因盒系统的概念提出,已发现和鉴定的整合子有10种类型,但只有5种和编码抗生素耐药性的基因盒相关,其中以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类研究的较多。第一类整合子最常见,从临床菌株中发现的整合子大多属于此类,其整合酶IntI1含有337个氨基酸。5’保守区有编码整合酶1的基因intI1、重组位点attI1和启动子Pant。其中Pant位于IntIl的编码框内,有的整合子还有启动子P2。大多数第一类整合子的3’保守区包括3个开放读码框(ORF)：磺胺耐药基因(sul-1),季铵盐化合物及溴乙锭的耐受基因(qacE△1)及功能不明的ORF5。可变区带有不同数量的基因盒,大部分是编码各种抗生素抗性的耐药基因盒。ISCR是由"insertion sequences" (ISs)和"commmon regions" (CRs)得来。它既可具有插入序列的特点,也具有共同区的特点。IS属于高度可移动性转座因子,对基因组一个或多个靶位点具有插入能力的小分子片段,并常可以移动邻近的基因。ISCR是一类IS91-like因子家族的成员,缺少反向重复序列,通过滚环方式转移邻近的耐药基因。ISCR成员中ISCR1研究最为广泛,它常出现在复杂性I类整合子。ISCR1介导一系列的转座事件发生,转座不同长度的耐药基因,如catA2、dfrA、qnr、blaCTX-M、blaCMY。ISCR1常连同耐药基因插入到普通的一类整合子的3’保守末端,介导形成复杂的一类整合子,如1n6和In7。另外,环状形式的ISCR1因子连同耐药基因直接插入到带有一个ISCR1拷贝的整合子3’保守末端,介导形成带有两个拷贝ISCR1因子的复杂的整合子,这些会导致菌株的耐药播散性更强。非发酵菌耐药机制是一群需氧无芽胞的G-杆菌,不能利用葡萄糖作为能量来源,或者通过发酵以外的代谢途径分解利用葡萄糖。它包括假单胞菌属、不动杆菌属、黄杆菌属、产碱杆菌属等。随着介入性诊疗技术的开展和新型抗生素、免疫抑制剂的广泛使用,非发酵菌感染的发生率和耐药性都有增加的趋势,临床诊疗带来困难。本课题针对临床分离的非发酵G-杆菌进行ISCR1和I类整合子相关耐药基因进行检测,从而了解ISCR1和I类整合子的携带耐药基因的分布特征,以及初步探讨这两者可能存在的串联结果。研究方法1。菌株的选取和基因组DNA提取收集南方医科大学南方医院检验科微生物室2008年1月至2009年12月临床分离的非重复非发酵G-杆菌,包括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、恶臭假单胞菌,总共809株。用SDS-蛋白酶K-酚-氯仿方法提取细菌的基因组DNA。2。I类整合子保守区(I类整合酶)和可变区(基因盒)检测分别扩增I类整合子保守区和可变区,然后利用限制性内切酶HinfⅠ和RsaⅠ酶切可变区,对PCR产物进行初步分类,挑选不同类型测序,分析同源性和耐药基因组合,申请GenBank序列号。3. ISCR1保守区(ISCR1转座酶)和可变区(ISCR1携带的耐药基因)检测采用ISCR1特异性引物进行PCR扩增,阳性菌株再扩增可变区,然后利用限制性内切酶HinfⅠ和RsaⅠ酶切可变区,对PCR产物进行初步分类,挑选不同类型测序,分析同源性和耐药基因组合,申请GenBank序列号。4。分析ISCR1和I类整合子可能存在的串联结构(复杂性I类整合子)ISCR1常与普通的I类整合子形成复杂性整合子,针对I类整合子可变区的3’-保守末端和ISCR1基因的保守序列设计引物,进行PCR扩增并测序,分析是否存在串联结构。研究结果1。检测到358株细菌携带I类整合酶,293株细菌携带基因盒本实验中检测到I类整合子携带的基因主要有耐氨基糖苷类,包括aacA4、aacC1、aac6-Ⅱ、aadA1、aadA2、aadA5、aadA13、aadB;耐甲氧苄啶类,包括dfrA1、dfrA15、dfrA17;β-内酰胺酶类,包括blaIMP-9、blaoxA-10、blaoXA-30、blaIMP-25、blaPSE-1;耐氯霉素类,包括catB8. catB3. cmlA8。809株G-非发酵菌的基因盒排列方式以及分布分别为：在376株鲍曼不动杆菌中,159株aacA4+catB8+aadAl,18株catB3+qnrVC-like+aacA4,14株aacC1+orfP+orfQ+aadA1,9株arr3+aacA4,4株dfrA15,1株aadB+aadA2;在240株铜绿假单胞菌中,32株blaIMP-9+aacA4+blaoxA-10+aadA2,10株aac(6’)-Ⅱ+aadA13+cmlA8+blaoXA-10a,8株aadB+blaPSE-1, 6株aacA4+blaIMP+blaoxA-30+catB3,3株dfrA12+orfF+aadA2,2株aacA4+aadA2,2株dfrA15,1株aadB+aac6-Ⅱ+pse-1,1株aacA4+catB3+dfrA1,1株aadB+aadA2;在106株嗜麦芽窄食单胞菌中,3株dfrA17+aadA5,2株aacA4+ blaIMP-25+blaOXA-30+catB3,1株qacF,1株dfrA15,1株aadB+aadA2;在75株洋葱伯克霍尔德菌中,7株aadB+aac6-Ⅱ+pse-1,2株aacA4+catB8+aadA1;在12株恶臭假单胞菌中,3株aadB+aac6-Ⅱ+pse-1,1株aadA1,1株blaIMP-9+aacA4+blaOXA-10+aadA2。2.检测到125株细菌ISCR1保守区阳性,18株ISCR1可变区阳性在125株ISCR1阳性菌株中,18株G-非发酵菌的ISCR1排列方式以及分布为：在376鲍曼不动杆菌中,8株ISCR1+qnrA1+ampR+qacE△1,6株ISCR1+blaPER-1+ABC transporter+qacE△1;在240株铜绿假单胞菌中,3株ISCR1+qnrA1+ampR+ qacE△1;在106株嗜麦芽窄食单胞菌中,1株ISCR1+qnrA1+ampR+qacE△1。3.检测到12株细菌含有复杂性I类整合子12株复杂性I整合子的排列方式及分布为：4株鲍曼不动杆菌含catB3+qnrVC-likecatB3+qnrVC-like+ISCR1+ blaPER-1+ABC tansporter+qacE△1,4株鲍曼不动杆菌和2株铜绿假单胞菌含dfrA15+ISCR1+qnrA1+ampR+qacE△1,1株鲍曼不动杆菌和1株嗜麦芽窄食单胞菌含aadB+aadA2+ISCR1+qnrAl+ampR+qacE△1。结论1.本院临床分离的非发酵G-杆菌I类整合酶的携带率为14.2%～61.7%,基因盒的携带率为17.5%～54.5%。2.本院临床分离的非发酵G-杆菌ISCR1转座酶的携带率为0～26.2%,在ISCR1阳性菌株中,ISCR1携带耐药基因比例为0-16.7%。3.本院临床分离的非发酵G-杆菌的I类整合子的耐药基因主要是耐氨基糖苷类、甲氧苄啶类、氯霉素类、β-内酰胺酶类。4.本院临床分离的非发酵G-杆菌的ISCR1携带的耐药基因主要是qnrA1。5.本院临床分离的非发酵G-杆菌的复杂性I类整合子携带的耐药基因以catB、aacA4、aadA2、aadB、dfrA15、qnr为主。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
前言  16-24
第一部分 Ⅰ类整合子研究  24-41
  1.1 材料  24-27
  1.2 方法  27-30
  1.3 结果  30-37
  1.4 讨论  37-41
第二部分 ISCR1相关耐药基因研究  41-50
  2.1 材料  41-42
  2.2 方法  42-43
  2.3 结果  43-48
  2.4 讨论  48-50
第三部分 Ⅰ类整合子和ISCR1共存结构研究  50-53
  3.1 材料  50-51
  3.2 方法  51-52
  3.3 结果  52
  3.4 讨论  52-53
全文总结  53-55
参考文献  55-65
附录  65-66
硕士期间完成和发表论文情况  66-67
致谢  67-69
统计学证明  69

临床分离非发酵G-杆菌Ⅰ类整合子及ISCR1的结构研究

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