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泛耐药肺炎克雷伯菌株的耐药机制与播散特点研究

作　者: 王艳艳
导　师: 蒋晓飞
学　校: 复旦大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 泛耐药肺炎克雷伯菌株 MLST ERIC PCR
分类号: R446.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae, Kpn)是条件致病菌,是院内感染的重要病原菌,占所有院内感染的10%左右。在免疫抑制的病人中,它是尿道感染,败血症和肺炎的常见病原菌。β-内酰胺酶类、喹诺酮类、氨基糖苷类和碳青霉烯类抗生素的广泛使用促使细菌耐药迅速出现。1983年在德国分离出了第一株产超广谱内酰胺酶(ESBLs) Kpn菌株,产ESBLs的Kpn菌株多呈多重耐药。Kpn是最常见的产ESBLs菌株的细菌,它对青霉素、第一代、第二代、第三代、第四代头孢菌素均耐药,但对碳氢霉烯类抗生素敏感。所以碳氢霉烯类抗生素作为产ESBLs的Kpn菌株的一线治疗药物。若临床出现产ESBLs菌株,会在患者和医院之间及不同菌株间相互传播,导致临床上高死亡率及高比率持续性定殖,已经引起高度的重视。早期ESBLs大多来源于TEM和SHV的突变,2000年之后ESBLs主要是CTX-M型。1996年,于美国分离出第一株产肺炎克雷伯碳氢霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase, KPC)的菌株,对碳青霉烯类抗生素耐药,导致抗菌感染治疗更加困难。近来出现了越来越多的对碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌,引起了世界各国抗感染专家和临床微生物工作者的极大关注。总之,肺炎克雷伯菌株的耐药日渐严重。2005年V. Miriagoul等和2009年Azza Elemam等已经报道了由泛耐药肺炎克雷伯菌株(pan-drug resistence Klebsiella pneumoniae PDR Kpn)引起的感染。但其具体的耐药机制尚不知道。2010年柳叶刀报道了产NDM-1金属酶的Kpn菌株,其具有泛耐药性,使泛耐药Kpn菌株引起了人们的高度关注。其后产NDM-1金属酶的泛耐药Kpn菌株在多国出现,可以在不同国家与地区间进行播散,且已有死亡病例。总之Kpn的耐药情况越来越严重,给临床的抗感染治疗和院内感染控制提出了更大的挑战。所以对Kpn进行耐药与播散方面的研究显得越发重要。我院2006年首次发现泛耐药Kpn菌株,2009年更是在短时间内出现了较广泛的爆发,因此加强对泛耐药Kpn菌株的监测及研究,对医院感染的监控与治疗具有较大的意义。第一部分泛耐药肺炎克雷伯菌株的耐药机制研究目的：调查上海华山医院2006年8月～2009年12月泛耐药Kpn菌株的分离率,以及耐药菌株的耐药表型,为临床合理应用抗生素提供依据。同时从分子水平上研究耐药株的耐药基因,为同种耐药基因型别菌株的分子流行学研究提供参考依据。方法：收集上海华山医院2006年8月～2009年12月共57株泛耐药Kpn菌株,按照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推荐的K-B纸片扩散法和微量肉汤稀释法对收集到的57株PDR Kpn检测其对CLSI推荐的21种抗菌药物的敏感性,根据CLSI2010年版的标准判断结果。采用ESBLs初筛试验和表型确证试验检测菌株是否产超广谱β-内酰胺酶。采用改良Hodge试验检测菌株是否产碳氢霉烯酶。采用等电聚焦电泳检测菌株产β-内酰胺酶情况。采用PCR及测序方法检测β-内酰胺酶耐药基因(blaCTX-M-、blaTEM-、blaSHV-blaKPC-、blaVIM-、blaIMP-和blaNDM-1-)、喹诺酮耐药基因(qnrA、qnrB和qnrS)、氨基糖苷类耐药基因aac(6’)-Ib和质粒介导的AmpC酶(MOX、CIT、DHA、ACC、EBC和FOX)。结果：药敏结果显示所有菌株对检测的全部抗生素高度耐药,并与文献"Panresistance in VIM-1-producing Klebsiella pneumoniae"表现出相似的耐药表型,所以57个菌株都认为是泛耐药Kpn菌株。ESBLs筛选试验和表型确证试验结果表明所有57株菌株都产ESBLs。改良Hodge试验显示所有菌株都产碳青霉烯酶。等电聚焦电泳(IEF)显示所有菌株均产4种β-内酰胺酶,等电点pI分别为5.4,6.7,7.9,8.2。blaCTX-M-、blaTEM-、blaSHV-、blaKPC-、qnrB-和aac(6’)-Ib-cr-特异性引物的PCR结果是阳性的。PCR产物测序结果表明所有的菌株都携带有blaTEM-1, blaCTX-M-14,blaSHV-12, blaKPC-2, qnrB和aac(6’)-Ib-cr。20株菌株含有DHA型质粒介导的AmpC酶。只有两株细菌含有blaVIM,经测序为blaVIM-1。讨论：近年来,Kpn已成为医院感染和免疫缺陷者感染的重要机会致病菌,该菌在免疫力低下或接受有创性诊疗的患者中可引起肺炎、败血症、尿道或腹腔内感染。由于广谱抗生素的不断使用,Kpn的耐药谱也随之扩大。因此,Kpn对抗菌药物的耐药性和临床治疗问题引起了全球极大的重视。我院的耐药的情况也极其严重,自2006年我院发现了第一株泛耐药Kpn,在之后的三年里数量不断增加,现已成为我院非常严重的问题,因此研究泛耐药Kpn的耐药机制是非常重要的。从2006年8月至2009年12月我们共收集到泛耐药Kpn 57株。所有57株细菌均产生ESBLs和碳氢霉烯酶。PCR扩增及其产物测序结果表明57株细菌都携带blaKPC-2、CTX-M-14、blaSHV-12、blaTEM-1和aac(6’)-Ib-cr,qnrB。推测是上述耐药基因编码的酶导致这些菌株对广谱β-内酰胺类、碳氢霉烯类、氨基糖苷类和喹诺酮类耐药。共同产TEM-1,SHV-12,CTX-M-14,KPC-2的Kpn菌株在我院院内流行播散。而且该耐药基因在院内播散转移,引起在我院的流行。但其在我院的播散流行特点尚不知道,需要进一步的研究。第二部分泛耐药肺炎克雷伯菌株的播散特点研究目的：为分析所收集的泛耐药菌株是如何流行的,可将分离株进行分子生物学分型,通过分型可以鉴定比较菌株是否一致,对于细菌性传染病监测,传染源的追踪、传播途径的调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。方法：采用多位点测序分型方法(MLST)以及肠杆菌间重复序列(ERIC PCR)对耐药菌株进行克隆分型,检验其是否是垂直播散。采用接合试验分析耐药基因是否是通过接合性质粒进行水平转移的,即耐药基因水平转移的能力。采用碱裂解法提取供体菌质粒DNA和接合子质粒DNA,电泳后进行分析。并对接合子质粒DNA进行酶切,通过酶切谱分析接合性质粒DNA的特点。根据菌株在病房内及病房间播散的各个环节设计试验,通过生长曲线、干燥试验和扩增抗消毒剂基因分析Kpn的生长能力、抗干燥和抗消毒剂的能力,以初步了解不同克隆株的生存能力和播散能力的差别。结果：ERIC PCR表明所有57株细菌呈2种不同的ERIC型别,MLST分析表明本批细菌呈两种不同的MLST等位基因谱：ST11和ST423。本研究中,ST11占主导(52株),ST423型有5株。MLST分析结果与ERIC结果一致。接合试验表明blaCTX-M-14,blaKPC-2,blaSHV-12,blaTEM-1是可以通过接合性质粒进行转移的。接合子的酶切图谱表明2个克隆株的接合性质粒不同,而相同的克隆株的接合性质粒相同。ST11较ST423生长能力强,耐干燥能力强。有18株(31.6%)具有抗消毒剂基因。结论：院内PDR Kpn菌株是ST11引起的克隆性播散,以垂直播散的方式进行；菌株有通过接合性质粒水平转移耐药基因的能力,而两个克隆株的接合性质粒不同,所以两个克隆株是以两条垂直播散途径进行的。ST11比ST423有更强的生长能力及耐干燥能力。可能与ST11型克隆株能在院内广泛播散有关。一部分PDR Kpn菌株有抗消毒剂的能力,可能是其在院内环境长期存在的原因。具有较强的生长能力、干燥能力和抗消毒剂能力的菌株可以在病房环境中长期存在,并进行播散。这也可能是ST11比ST423得到更广泛流行播散的原因。第三部分寻找泛耐药肺炎克雷伯菌株的有效治疗药物目的：寻找泛耐药肺炎克雷伯菌株的有效治疗药物。方法：为了找到有效药物治疗泛耐药Kpn所引起的感染,扩大泛耐药Kpn的药敏试验谱。即在CLSI推荐的药物之外,增加几种抗生素进行药敏试验,指导临床单独用药。抗生素包括多西环素、米诺环素、多粘菌素和替加环素。结果：泛耐药Kpn菌株对多粘菌素、多西环素和米诺环素均有不同程度的敏感性,敏感率分别为74.14%、60.34%和74.14%。但所有泛耐药Kpn菌株对替加环素耐药,而产NDM-1金属酶的Kpn菌株对替加环素是敏感的。其耐药机制还需进一步研究。结论：多粘菌素、多西环素和米诺环素可做为泛耐药Kpn菌株有效的选择药物。替加环素对泛耐药Kpn菌株是无效的,不可作为临床治疗药物选择。

泛耐药肺炎克雷伯菌株的耐药机制与播散特点研究

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