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基于微流控技术的感染性病原体基因诊断研究

作　者: 王秋平
导　师: 周小棉
学　校: 广州医学院
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 芯片电泳毛细管PCR 乙型肝炎病毒拉米夫定耐药变异新德里金属-β-内酰胺酶-1( New Delthi Metallo-bata–Lactamase,NDM-1)
分类号: R440
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本论文工作利用微流控技术发展感染性疾病基因诊断方法,为微流控技术用于临床检验作出有益的尝试。论文研究内容包括:1.微流控芯片电泳用于乙型肝炎病毒YMDD基因变异检测目的:利用芯片电泳高分辨力和分析快速的优势,发展一种多重PCR与芯片电泳结合的方法,用于乙型肝炎病毒YMDD基因突变快速检测。方法:发展一种序列特异性多重PCR,用于YMDD变异基因:YVDD和YIDD的扩增。针对上述序列特异性多重PCR,发展一种芯片电泳DNA片段长度计算方法用于YVDD和YIDD基因扩增产物鉴定。将一定浓度的YMDD标准质粒与YVDD和YIDD标准质粒按不同比例混合,考察多重PCR-芯片电泳方法对上述混合样品中突变基因的检测灵敏度。使用本研究发展的YMDD基因变异检测方法分析86例经拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者血清样品中YMDD突变情况,并将其结果与荧光定量PCR比较。两种方法结果不一致的标本经测序鉴定。结果:芯片电泳法能够在3分钟内实现YMDD变异基因扩增产物的检测,并能够鉴定突变型(YVDD和YIDD)扩增产物。标准YVDD、YIDD质粒的检测限均达到101拷贝/μl;不同比例(V:M或I:M)混合质粒的分析结果显示,该方法可以检测含量为5%的YVDD变异以及含量10%的YIDD变异。86例经拉米夫定治疗的乙型肝炎患者标本中,芯片电泳法检测YMDD总变异65例突变率为75.6%(65/86),荧光定量PCR检出YMDD总变异62例,突变率为72.1%(62/86)。芯片电泳与荧光定量PCR法检测结果的χ2分析结果提示,两种方法所获得结果具有一致性(Kappa=0.609,P>0.05)。两种方法检测结果不一致的20例标本测序结果显示,芯片电泳法与测序结果符合率为95%。结论:本工作发展的结合多重PCR和芯片电泳的YMDD变异检测方法,不但具有准确、简单、快速、灵敏的特点,而且不需要昂贵的探针和费力测序程序,检测成本效益低。因此,该方法有潜力应用于乙型肝炎患者接受拉米夫定治疗的YMDD突变检测。2.基于毛细管直接PCR的新德里金属-β-内酰胺酶-1耐药基因快速和灵敏检测目的:利用毛细管直接PCR发展一种用于新德里金属-β-内酰胺酶-1(New Delthi Metallo-bata -Lactamase,NDM-1)耐药基因快速和灵敏检测的方法。方法:采用改良型高性能的DNA聚合酶,发展一种液体振荡流毛细管直接PCR,结合芯片电泳检测实现NDM-1基因阳性菌的快速鉴定。考察该方法进行NDM-1基因扩增的酶浓度、标本用量,以及扩增的退火温度和延伸时间。通过输入标准样品考察上述方法的灵敏度和特异性。利用毛细管直接PCR和常规PCR法对临床微生物检测的70株肠道杆菌和55株鲍曼不动杆菌(亚胺培南MIC≧64μg/ml)的NDM-1基因进行检测,并对阳性标本进行测序验证。结果:在优化的分析条件下,相比常规PCR,毛细管直接PCR反应所需试剂用量更少(只需3μL),完成DNA扩增时间更短(只需16 min)。毛细管直接PCR效果随着酶浓度的增加而提高,当酶加入量为0.5μL时趋向于饱和;最合适检测标本体积为2μL;每个循环中在68℃温区暂停10 s,将退火和延伸时间加长,芯片电泳荧光信号达最大值。结合芯片电泳检测,该方法检测最低限为1.15×102 CFU /mL。125例临床样本中,两种方法检测出2例NDM-1基因阳性。2例阳性标本基因扩增产物的测序结果与Genbank比对符合率为100%。结论毛细管直接PCR联合芯片电泳方法能实现NDM-1耐药基因的快速扩增和检测。该方法具有成本低廉、操作简单、反应快速、特异性强,高灵敏等特点,适合于临床NDM-1基因(+)耐药菌的早期快速检测。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-8
第一部分微流控芯片电泳用于乙型肝炎病毒 YMDD 变异检测  8-27
  前言  8-10
  材料与方法  10-16
  结果  16-22
  讨论  22-23
  结论  23-24
  参考文献  24-27
第二部分基于毛细管直接PCR 的新德里金属-β-内酰胺酶-1 耐药基因快速和灵敏检测  27-46
  前言  27-36
  结果  36-41
  讨论  41-42
  结论  42-43
  参考文献  43-46
综述  46-64
  参考文献  58-64
已发表和待发表的的论文  64-65
致谢  65-67

基于微流控技术的感染性病原体基因诊断研究

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