学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

常见致病性弧菌的基因分型和基因芯片检测技术研究

作　者: 丁久法
导　师: 潘迎捷
学　校: 上海海洋大学
专　业: 食品科学与工程
关键词: 基因芯片 ERIC-PCR 副溶血性弧菌致病性弧菌检测
分类号: TS207.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 72次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)等致病性弧菌都是重要的食源性致病菌,广泛存在于海水、海底沉积物以及鱼贝虾蟹等海产品中,人们食用受该类菌污染的食物后会引起腹泻、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应,重症患者还会脱水、休克,甚至死亡。1998年以来的报道显示,副溶血性弧菌引发的食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势,均已超过沙门氏菌,跃居我国细菌性食物中毒的首位。因此,发展一套高通量、快速、准确、全面的常见致病性弧菌的检测和分型方法是保障食品质量安全和应对水产品来源食物中毒事故的关键。针对副溶血性弧菌运用ERIC-PCR分子分型方法,分析了副溶血性弧菌标准菌株和分离株的参考指纹图谱,初步探讨了ERIC-PCR技术在副溶血性弧菌流行病学调查和同源性追踪上的应用价值;并结合PCR技术检测了副溶血性弧菌不同菌株所携带毒力基因耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热直接相关溶血素基因(trh)的情况,以分析毒力菌株的分布,为预防与治疗食物中毒提供科学依据。结果显示,通过ERIC-PCR技术,26株副溶血性弧菌都可扩增产生可重复的DNA指纹图谱,可将26株菌分为12个型,分辨力指数为0.926,并且与脉冲场凝胶电泳(PFGE)的分型验证结果基本一致;毒力基因检测的结果表明,只在临床分离菌株中检测到了tdh基因,而除一株标准菌株外,其它菌株都未检测到trh基因。根据编码副溶血性弧菌的不耐热直接溶血素(TLH)、耐热直接溶血素(TDH)和TOXR蛋白的tlh、tdh、toxR基因以及16S rDNA四种基因设计引物和探针,进行多重PCR扩增和芯片检测,并通过40株菌来对该方法进行评价。所有副溶血性弧菌菌株都在相应探针处检测到阳性信号,仅有溶藻弧菌和拟态弧菌在16S rDNA探针处显示假阳性信号,而在tlh、tdh、toxR探针处显示特异性很好,该方法对副溶血性弧菌基因组DNA的检测限为7.5pg,对模拟食品样品中的副溶血性弧菌的检测限为200 CFU/mL。同时运用我们建立的成熟的多重PCR技术对食源性致病菌—大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌进行了四重PCR扩增检测,结果表明我们建立的四重PCR技术能同时高特异性地检测出大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌。通过对副溶血性弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌的16S rDNA全序列进行软件比对,寻找四种弧菌的16S rDNA的差异序列,针对其序列差异很小的特点在恒定区设计了一对通用性引物,并在正反向都标记了荧光。在可变区设计了4条特异性寡核苷酸探针,建立四种弧菌的芯片检测方法,通过40株菌对该方法进行了评价,结果显示该芯片能成功将四种弧菌进行快速检测区分,且特异性强。本研究建立了副溶血性弧菌的基于ERIC-PCR的基因分型方法和常见致病性弧菌的基因芯片检测技术,能够为副溶血性弧菌以及其它弧菌感染的诊断与预防提供可靠的技术手段,为保障食品安全提供了又一道屏障。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-12
引言  12-16
  1 研究背景  12-15
  2 研究目的及意义  15-16
第一章 ERIC-PCR 和基因芯片技术概述  16-24
  1.1 ERIC-PCR 概述  16-18
    1.1.1 ERIC-PCR 的基本原理  16-17
    1.1.2 ERIC-PCR 的技术特点  17
    1.1.3 ERIC-PCR 技术在致病菌基因分型研究中的应用  17-18
  1.2 基因芯片技术概述  18-22
    1.2.1 基因芯片的基本原理  18
    1.2.2 基因芯片的主要类型  18-19
    1.2.3 基因芯片的主要特点  19-20
    1.2.4 基因芯片技术的流程  20-21
    1.2.5 基因芯片在食源性致病菌检测中的应用  21-22
  1.3 展望  22-24
第二章副溶血性弧菌ERIC-PCR 分型方法的建立及毒力基因的检测  24-35
  2.1 实验材料  24-25
    2.1.1 菌株及来源  24
    2.1.2 主要培养基和试剂  24
    2.1.3 试剂盒  24-25
    2.1.4 引物  25
    2.1.5 PCR 反应试剂  25
    2.1.6 琼脂糖凝胶电泳用试剂  25
    2.1.7 主要仪器  25
  2.2 方法  25-29
    2.2.1 DNA 模板的制备  25-26
    2.2.2 ERIC-PCR 及毒力基因的引物  26-27
    2.2.3 ERIC-PCR 及毒力基因检测方法的建立  27-28
    2.2.4 ERIC-PCR 重复性实验  28
    2.2.5 ERIC-PCR 反应产物分析  28-29
    2.2.6 副溶血性弧菌ERIC-PCR 指纹图谱分析  29
  2.3 结果  29-32
    2.3.1 ERIC-PCR 的重复性  29
    2.3.2 副溶血性弧菌ERIC-PCR 扩增结果  29-30
    2.3.3 副溶血性弧菌ERIC-PCR 指纹图谱的分析  30-31
    2.3.4 tdh 和trh 基因检测结果  31-32
  2.4 讨论  32-35
    2.4.1 副溶血性弧菌基因分型的重要性  32-33
    2.4.2 基因分型方法的选择  33-35
第三章副溶血性弧菌多重PCR 检测方法的建立  35-46
  3.1 实验材料  35-36
    3.1.1 菌株  35
    3.1.2 主要培养基  35
    3.1.3 试剂盒  35
    3.1.4 引物  35-36
    3.1.5 PCR 反应试剂  36
    3.1.6 琼脂糖凝胶电泳用试剂  36
    3.1.7 主要仪器  36
  3.2 方法  36-38
    3.2.1 菌株的培养  36
    3.2.2 DNA 模板的制备  36
    3.2.3 多重PCR 引物的设计  36-37
    3.2.4 多重PCR 方法的建立  37
    3.2.5 多重PCR 体系优化  37-38
    3.2.6 多重PCR 引物特异性分析  38
    3.2.7 多重PCR 灵敏度试验  38
  3.3 结果  38-43
    3.3.1 多重PCR 体系优化  38-41
    3.3.2 多重PCR 引物特异性分析  41
    3.3.3 多重PCR 灵敏度试验  41-42
    3.3.4 多重PCR 对大肠杆菌0157 和单核增生李斯特菌的检测  42-43
  3.4 讨论  43-46
    3.4.1 多重PCR 的优劣  43-44
    3.4.2 多重PCR 的优化  44
    3.4.3 多重PCR 特异性与灵敏度评价  44-46
第四章副溶血性弧菌基因芯片检测方法的建立  46-56
  4.1 实验材料  46-48
    4.1.1 菌株  46
    4.1.2 主要培养基  46
    4.1.3 试剂盒  46
    4.1.4 芯片引物与探针  46
    4.1.5 PCR 反应试剂  46
    4.1.6 PCR 产物纯化试剂  46
    4.1.7 芯片杂交用试剂  46-47
    4.1.8 仪器设备  47
    4.1.9 醛基化修饰表面片基  47-48
  4.2 方法  48-52
    4.2.1 菌株的培养及模板DNA 的制备  48
    4.2.2 V.p 特异性基因的探针引物设计  48-49
    4.2.3 PCR 的反应体系  49-50
    4.2.4 PCR 产物纯化  50
    4.2.5 点制芯片  50-51
    4.2.6 芯片杂交和洗片  51-52
    4.2.7 芯片扫描和数据分析  52
    4.2.8 芯片检测特异性  52
    4.2.9 芯片检测灵敏度  52
    4.2.10 食品中致病微生物的检测  52
  4.3 结果  52-54
    4.3.1 基于多重PCR 的芯片检测  52-53
    4.3.2 芯片检测灵敏度试验  53-54
    4.3.3 模拟样品中致病微生物的检测  54
    4.3.4 食品中致病微生物的检测  54
  4.4 讨论  54-56
    4.4.1 探针的设计及特异性评价  54-55
    4.4.2 芯片检测的灵敏度评价  55-56
第五章常见致病性弧菌基因芯片鉴定方法的建立  56-63
  5.1 实验材料  56
    5.1.1 菌株  56
    5.1.2 主要培养基  56
    5.1.3 试剂盒  56
    5.1.4 芯片引物与探针  56
    5.1.5 PCR 反应试剂  56
    5.1.6 PCR 产物纯化试剂  56
    5.1.7 芯片杂交用试剂  56
    5.1.8 仪器设备  56
    5.1.9 醛基化修饰表面片基  56
  5.2 方法  56-59
    5.2.1 菌株的培养及模板DNA 的制备  56-57
    5.2.2 PCR 的反应体系  57
    5.2.3 常见致病性弧菌165 rDNA 基因的引物和探针引物设计  57-58
    5.2.4 PCR 产物纯化  58
    5.2.5 点制芯片  58
    5.2.6 芯片杂交和洗片  58
    5.2.7 芯片扫描和数据分析  58-59
    5.2.8 芯片检测特异性  59
    5.2.9 芯片检测灵敏度  59
    5.2.10 食品中致病微生物的检测  59
  5.3 结果  59-61
    5.3.1 基于弧菌165 rDNA 基因的芯片检测  59-60
    5.3.2 芯片检测灵敏度试验  60-61
    5.3.3 模拟样品中致病微生物的检测  61
    5.3.4 食品中致病微生物的检测  61
  5.4 讨论  61-63
    5.4.1 探针的设计与特异性评价  61
    5.4.2 Vibrio spp.鉴定芯片的灵敏度评价  61
    5.4.3 Vibrio spp.鉴定芯片的不足与改进  61-63
全文总结  63-65
本论文创新点  65-66
参考文献  66-73
攻读硕士学位期间发表的文章  73-74
致谢  74

常见致病性弧菌的基因分型和基因芯片检测技术研究

内容摘要

全文目录

相似论文