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拮抗芽孢杆菌的分离鉴定及其多样性和系统发育分析

作　者: 刘芳
导　师: 高学文
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 拮抗芽孢杆菌 多样性 ERIC-PCR指纹图谱 16S rRNA和gyrB基因序列 促生作用和促种子萌发 低温适生芽孢杆菌
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


已有研究者对中药源、乳酪、白酒糟醅、极端环境和土壤来源芽抱杆菌进行了分类和资源调查研究,但尚未有对拮抗芽孢杆菌进行分类和资源研究的报道。通过分类研究揭示拮抗芽抱杆菌的生物多样性及其系统发育地位,对深入发掘、保存及合理利用芽孢杆菌种质资源有重要的理论价值和现实意义。本研究从中国江苏省、黑龙江省、海南省和新疆维吾尔自治区采集到不同生境土样28份,利用传统方法,分离鉴定到1593个芽孢杆菌,并从中筛选出了545个对植物病原真菌(Sclerotinia sclerotiorum)和病原细菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)有良好抑菌活性菌株。从各省区不同地区挑选具有良好抑菌活性的芽孢杆菌330个,运用ERIC-PCR扩增其基因间重复序列,对指纹图谱进行聚类分析,结果显示,在78%的相似度下各地区拮抗芽孢杆菌被分为若干群,最多的新疆阿克苏地区被分为16个群,最少的海南地区被分为10个群,说明拮抗芽孢杆菌在各地的分布具有很好的多样性。进一步分析数据发现,选出的拮抗菌大多数集中在解淀粉芽孢杆菌群(Bacillus amyloliquefaciens group)、枯草芽孢杆菌群(B. Subtilis group)、短小芽孢杆菌群(B. pumilus group)和巨大芽孢杆菌群(B. megatrium group)。对于不同省区的拮抗芽孢杆菌,南部主要以B. megatrium group为主,北部和西部主要以B. pumilus group为主,而东部由于分离菌株较少没有找到拮抗菌；同一省区新疆维吾尔自治区的不同地区,拮抗菌优势种群不一样,南疆地区B. amyloliquefaciens group分布较少,而北疆地区B. megatriumgroup分布较少。不同生境对于拮抗芽孢杆菌的分布没有特别影响。从330个具有良好抑菌活性的芽孢杆菌中,选取对病原真菌的抑菌圈达到25mm以上,对病原细菌的抑菌圈达到30mm以上的24株有较高抑菌活性的菌株,进行形态学,生理生化学测定,并扩增了其16S rRNA和gyrB基因序列,结合它们的ERIC-PCR指纹图谱聚类分析,我们发现,聚类分析结果与gyrB基因序列鉴定结果具有良好的一致性。以此说明利用ERIC-PCR旨纹图谱进行多样性分析具有可靠性。本研究同时还对西藏具有拮抗作用的菌株进行了低温适生菌筛选,结果找到2株(RJGP41和CJLC2)能在4℃下生长,25株能在10℃下生长良好的菌株,命名为低温适生芽孢杆菌。结合促拟南芥生长和促玉米种子萌发实验,我们找到菌株RJGP41,CJLC2, GBSC56和NMSL88有较好的促生长作用,且在低温下也能稳定促进玉米生长。经16S rDNA扩增测序,将它们分别鉴定到种：RJGP41属于B. simplex; CJLC2属于B.megaterium; GBSC56属于B. atropheus; NMSL88属于B.cereus。对27个低温适生菌进行抗菌谱测定,结果显示LSSC3 (B.subtilis)具有较强的抗菌作用,尤其对病原真菌。这些低温菌具有耐低温和促生、抗菌的双重作用,在农业生产上具有应用的潜力。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11上篇 文献综述  11-32  前言  12  1 芽孢杆菌的分类及现状  12-18    1.1 芽孢杆菌的分类历史  12-14    1.2 芽孢杆菌的分类现状  14-18  2 芽孢杆菌的分类方法  18-26    2.1 细菌分类方法演变  18-19    2.2 芽孢杆菌的多相分类  19-26  3 芽孢杆菌的多样性研究  26-27  4 芽孢杆菌的应用及其研究进展  27-32    4.1 在农业中的应用  27-28    4.2 在水产养殖中的作用  28-29    4.3 在畜牧业中的应用  29    4.4 在工业中的应用  29-30    4.5 在食品加工和保鲜中的应用  30    4.6 在医学上的应用  30-31    4.7 在科学研究中的作用  31    4.8 在环境保护中的应用  31-32下篇 研究内容  32-76  第一章 国内不同省区芽孢杆菌的分离鉴定及拮抗菌筛选  34-46    1 材料和方法  34-38      1.1 培养基  34-35      1.2 试验试剂仪器  35-36      1.3 供试菌株  36      1.4 试验方法  36-38    2 结果分析  38-44      2.1 芽孢杆菌分离  38-40      2.2 颉颃菌株的筛选  40-41      2.3 形态和生理生化鉴定  41-44    3 讨论  44-46  第二章 拮抗芽孢杆菌的分类及其多样性和系统发育分析  46-58    1. 材料和方法  47-50      1.1 菌株  47      1.2 培养基  47      1.3 试剂和引物合成  47      1.4 基因组提取  47-48      1.5 ERIC-PCR扩增  48      1.6 ERIC-PCR指纹图谱分析  48      1.7 16S rRNA基因PCR扩增  48-49      1.8 DNA促旋酶gyrB基因的PCR扩增  49      1.9 DNA片断的回收  49      1.10 16S rRNA和gyrB基因序列分析  49-50    2. 结果与分析  50-55      2.1 菌株ERIC-PCR指纹图谱分析  50-52      2.2 16S rRNA和gyrB基因序列比对  52-55    3. 讨论  55-58  第三章 西藏低温适生芽孢杆菌分离鉴定及其抗菌和促生作用  58-76    1 材料和方法  59-62      1.1 供试菌株  59      1.2 培养基及试剂  59      1.3 低温适生菌的分离筛选  59-60      1.4 低温菌生长温度范围测定  60      1.5 形态学鉴定  60      1.6 低温适生菌抗菌活性检测  60      1.7 低温菌促植物生长  60-61      1.8 基因组提取  61      1.9 低温适生芽孢杆菌的鉴定  61-62    2 结果与分析  62-72      2.1 低温适生菌的筛选  62      2.2 低温适生菌生长温度范围测定  62-65      2.3 形态鉴定  65      2.4 低温适生菌对病原菌的拮抗作用  65-68      2.5 低温适生菌促生长测定  68-69      2.6 低温适生菌对玉米种子萌发测定  69-72      2.7 16S rRNA基因序列鉴定  72    3 讨论  72-76参考文献  76-86附录  86-96致谢  96-98攻读硕士学位期间发表的论文  98

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用
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