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肺炎克雷伯菌质粒介导AmpCβ-内酰胺酶耐药基因研究

作　者: 张运丽
导　师: 刘文恩
学　校: 中南大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 肺炎克雷伯菌 质粒 AmpCβ-内酰胺酶 DHA ERIC-PCR
分类号: R440
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的了解湖南地区中南大学三所附属医院(湘雅医院、湘雅二医院、湘雅三医院)肺炎克雷伯菌中质粒介导AmpCβ-内酰胺酶的检出情况,确定其基因型,进行流行病学分析,了解产质粒介导AmpCβ-内酰胺酶菌株的耐药性,为临床治疗提供参考。方法收集中南大学三所附属医院2004年10月至2005年7月间非重复肺炎克雷伯菌110株,保存于脱脂牛奶管中,放置于-70℃冰箱。所有菌株采用法国生物梅里埃公司的全自动微生物鉴定系统VITEK-2的GN卡鉴定和AST GN-13卡进行药敏分析。采用头孢西丁纸片试验对110株非重复肺炎克雷伯菌进行AmpC酶初筛,提取初筛阳性菌株的质粒,以其为模板采用多重PCR法进行blaMOX、blaCIT、blaDHA、blaACC、blaEBC、blaFOX型基因扩增,用特异性引物对阳性菌株进行相应基因整个开放阅读框PCR扩增,将特异性PCR扩增的DNA产物纯化后进行测序分析,通过BLAST将测序结果与基因库已知序列进行对比分析,确定其基因型。对证实携带质粒AmpC酶的菌株采用肠杆菌科基因组内重复一致序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)进行菌株DNA的同源性分析。结果从110株临床分离的非重复肺炎克雷伯菌中共检出对头孢西丁不敏感菌24株。提取其质粒作为模板,经多重PCR扩增24株肺炎克雷伯菌中有21株获得阳性结果,均携带DHA型质粒AmpC酶基因。以特异性DHA引物进一步扩增及测序,经GenBank网上同源性比较,本次试验菌株所携带的质粒介导AmpC酶耐药基因全部为DHA-1型耐药基因。对携带DHA型耐药基因的菌株进行ERIC-PCR流行病学分型,21株肺炎克雷伯菌ERIC-PCR图谱可分为6种克隆类型,结果显示在一些肺炎克雷伯菌中存在ERIC-PCR图谱类型的高度一致性。药敏检测结果显示产质粒介导AmpC酶的肺炎克雷伯菌对大多数新型广谱β-内酰胺类药物耐药,对亚胺培南敏感。结论(1)湖南地区临床分离的肺炎克雷伯菌中已经出现质粒介导AmpC酶菌株,基因型以DHA-1型为主。加强对肺炎克雷伯菌产质粒介导AmpCβ-内酰胺酶的检测,对控制质粒AmpC酶传播具有重大的意义。(2)在一定程度上DHA-1型质粒介导的AmpCβ-内酰胺酶存在克隆传播,其耐药性除了通过质粒传播外还能够水平传播,给临床抗感染治疗带来重大威胁。(3)对产AmpC酶菌引起感染的治疗,应根据细菌药敏试验结果,合理选择有效的抗菌药物治疗。产质粒介导AmpC酶的肺炎克雷伯菌对大多数新型广谱β-内酰胺类抗生素耐药,碳青霉烯类和第四代头孢菌素可作为治疗产AmpC酶菌株感染的有效药物。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
缩略词表  10-11
第一章 前言  11-13
第二章 材料和方法  13-21
  2.1 材料  13-16
    2.1.1 临床菌株  13
    2.1.2 标准菌株  13
    2.1.3 主要试剂  13-14
    2.1.4 主要仪器  14-16
  2.2 方法  16-21
    2.2.1 技术路线  16
    2.2.2 细菌的培养、保存、鉴定及药敏  16
    2.2.3 AmpC酶表型检测  16-17
    2.2.4 细菌质粒DNA提取  17
    2.2.5 引物合成  17-18
    2.2.6 多重PCR检测blaMOX、blaCIT、blaDHA、blaACC、blaEBC、blaFOX基因  18-19
    2.2.7 特异性PCR扩增  19
    2.2.8 菌株DNA同源性分析  19-20
    2.2.9 特异性PCR扩增产物测序及基因型的确定  20-21
第三章 结果  21-28
  3.1 AmpC酶表型检测结果  21
  3.2 多重PCR检测质粒介导的AmpC酶结果  21-22
    3.2.1 质粒提取结果  21
    3.2.2 质粒介导的AmpC酶扩增结果  21-22
  3.3 特异性PCR扩增DHA型质粒介导的AmpC酶结果  22-23
  3.4 ERIC-PCR结果  23-24
  3.5 测序结果  24-27
  3.6 产DHA型质粒AmpC酶的21株肺炎克雷伯菌药物敏感试验结果  27-28
第四章 讨论  28-33
  4.1 AmpC酶表型检测结果分析与讨论  28-29
  4.2 多重PCR结果分析与讨论  29-30
  4.3 DHA特异性PCR扩增及测序结果与讨论  30-31
  4.4 产质粒介导AmpC酶肺炎克雷伯菌ERIC-PCR分析  31-32
  4.5 21株产质粒介导AmpC酶肺炎克雷伯菌的药敏结果分析讨论  32-33
第五章 结论  33-34
参考文献  34-38
综述  38-49
致谢  49-50
攻读学位期间研究成果  50

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学
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