学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

p53依赖性和非依赖性信号通路在邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯致肝细胞凋亡中的调控机制

作　者: 杨光涛
导　师: 袁晶
学　校: 华中科技大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯 邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯 氧化性DNA损伤 p53 RNA干扰 线粒体通路 Fas/FasL通路 细胞凋亡
分类号: R131
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 414次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


邻苯二甲酸二(2—乙基)己酯(Di-(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)是塑料工业中使用最广泛的一类增塑剂,它主要用来增加塑料的弹性和柔韧性。由于DEHP在塑料中以非共价键形式存在,并可随着使用时间的推移而不断释放至大气、土壤和水体中,人体可通过呼吸道、消化道和皮肤多途径持续地暴露于环境中的DEHP。为此,DEHP的潜在健康危害已倍受国内外学者的关注。研究表明,进入机体的DEHP很快被代谢为活性中间产物—邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯mono-(2-ethylhexyl) phthalate, MEHP),产生肝脏毒性、肾脏毒性和生殖发育毒性等。体外研究显示,MEHP可致多种细胞的凋亡,但尚不了解其分子调控机制。MEHP是过氧化物酶体增殖物(peroxisome proliferators, PP),它可经氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators activated receptors, PPAR)介导肝毒性。但是,MEHP致肝毒性的调控机制并非完全依赖PPAR途径,可能与孕烷X受体(pregnane X receptor, PXR)有一定的关联。细胞凋亡是外环境刺激或死亡信号所触发的细胞主动死亡过程,该过程受多个基因的调控,其中抑癌基因p53发挥主要调控作用。活化p53通过转录调控下游凋亡基因,如bax-, bcl-2和puma等激活线粒体凋亡通路引起细胞凋亡。研究发现,在MEHP引起的生殖细胞凋亡过程中有p53蛋白的高表达。但是,细胞凋亡并非仅受p53介导的细胞信号通路的调控,p53非依赖信号通路,如c-Jun氨基末端激酶-促分裂素原活化蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinases-mitogen activated protein kinases, JNK-MAPK)途径和Fas/FasL途径等也可参与其调控。不过迄今仍不清楚在MEHP致肝细胞凋亡中p53依赖性和非依赖性信号通路是否参与了调控。基于此,本研究拟用MEHP处理人胚肝细胞L02和人肝癌细胞HepG2来研究MEHP致肝细胞毒性和氧化损伤变化,以及p53介导的线粒体通路在MEHP致肝细胞凋亡中的调控机制,并探索性研究Fas/FasL在p53非依赖性信号通路调控MEHP致肝细胞凋亡中的作用,旨在为后续深入研究MEHP致肝细胞毒性的分子机制提供科学依据。本研究包括以下三个部分：第一部分MEHP致人肝细胞氧化性DNA损伤和细胞凋亡的研究目的：建立MEHP染毒L02细胞和HepG2细胞模型。方法：MEHP设定浓度为6.25μM、12.50μM、25.00μM、50.00μM和100.00μM,二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照(终浓度≤0.1%),检测内容包括：①MTT检测细胞活力；②试剂盒检测细胞丙二醛(maleic dialdehyde, MDA)水平、超氧化物酶(superoxide dimutese, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)的活性；③高效液相色谱仪(HPLC)检测细胞8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)水平；④流式细胞仪和TUNEL检测细胞凋亡变化。研究结果如下：(一)细胞活力①用MEHP处理L02细胞12h,仅在50.00μM处理组检出细胞活力上升(p<0.05)；在24h时点,50.00μM和100.00μM处理组的细胞活力均显著性降低p<0.05或p<0.01)；在36h时点,较高浓度MEHP处理组(≥25.00μM)细胞的活力均显著性降低(p<0.05或p<0.01)。②用MEHP处理HepG2细胞12h,在50.00μM和100.00μM处理组的细胞活力显著性下降(p<0.01)。在24h和36h时点,细胞活力随MEHP浓度的升高而逐渐降低,在较高浓度的MEHP处理组(≥25.00μM),细胞活力均显著性降低p<0.01)。(二)细胞的氧化损伤①用MEHP处理L02细胞和HepG2细胞12h,在所有处理组均未观察到MDA水平的变化p>0.05)。在24h和36h时点,较高浓度的MEHP处理L02细胞(≥25.00μM)的MDA水平均显著性升高p<0.05或p<0.01)。用MEHP处理HepG2细胞24h,所有处理组的MDA水平均显著性升高(p<0.01)；在36h时点,除6.25μM处理组外,所有MEHP处理组的MDA水平均显著性升高(p<0.01)。②用MEHP处理L02细胞12h,所有处理组细胞的SOD活性均无显著性变化(p>0.05)；在24h时点,所有处理组细胞的SOD活性均显著性降低(p<0.05或p<0.01)；在36h时点,较高浓度MEHP处理组(≥25.00μM)细胞的SOD活性也显著性降低p<0.01)。MEHP处理HepG2细胞12h,所有MEHP处理组细胞的SOD活性均无显著性变化(p>0.05)；在24h时点,仅观察到100.00μM处理组细胞的SOD活性降低(p<0.05)；在36h时点,50.00μM和100.00μM处理组细胞的SOD活性均降低p<0.05)。③MEHP处理L02细胞12h和24h,所有MEHP处理组均为观察到细胞GSH-Px活性的变化p>0.05)；在36h时点,除6.25μM处理组外,其他处理组细胞的GSH-Px活性均降低p<0.05)。用MEHP处理HepG2细胞12h,在所有处理组未观察到GSH-Px活性的变化(p>0.05)；在24h和36h时点,除6.25μM处理组外,其他处理组细胞的GSH-Px活性均显著性降低p<0.05)。(三)细胞8-OHdG水平①MEHP处理L02细胞24h和36h,仅在24h时点的50.00μM和100.00μM处理组和36h时点的100.00μM处理组8-OHdG水平有显著性升高p<0.05或p<0.01);②MEHP处理HepG2细胞24h和36h,在24h时点>25.00μM的各处理组和36h时点的100.00μM处理组细胞的8-OHdG水平有显著性升高p<0.05或p<0.01)。(四)细胞凋亡①流式细胞仪检测结果显示：MEHP处理L02细胞24h和36h,在50.00μM和100.00μM处理组的细胞凋亡率均显著性增加(p<0.01)。MEHP处理HepG2细胞24h和36h,观察到24h时点100.00μM处理组和36h时点>25.00μM各处理组的细胞凋亡率显著性增加(p<0.01)。②TUNEL结果显示：MEHP处理L02细胞24h和36h,50.00μM和100.00gM处理组有绿色荧光标记的凋亡细胞数明显增多。MEHP处理HepG2细胞24h,仅发现100.00μM组绿色荧光标记的凋亡细胞略有增多；在36h时点,在25.00μM处理组已发现绿色荧光标记的凋亡细胞数有明显增多。结论：MEHP可致L02细胞和HepG2细胞氧化应激和氧化性DNA损伤,并导致细胞凋亡。第二部分p53介导线粒体通路在MEHP致肝细胞凋亡中的调控作用第一部分研究结果提示：MEHP并非完全依赖于PPAR途径致肝细胞凋亡。因此,本部分将进一步研究PXR受体途径的相关基因、蛋白质表达水平和酶活性的变化,以及p53介导线粒体通路在MEHP致L02细胞和HepG2细胞凋亡中的调控作用。方法：MEHP设定浓度为6.25μM、12.50μM、25.00μM、50.00μM和100.00μM,二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照(终浓度≤0.1%),检测内容包括：①实时荧光定量RT-PCR检测pxr基因mRNA表达；②estern blotting检测CYP3A4蛋白表达,7-乙氧基香豆素O-去乙基酶(ECOD)检测CYP3A4酶活性；③estern blotting检测p53、p-p53、MDM2、 Bax、Bcl-2、PUMA和NOXA蛋白表达；④HPLC检测细胞ATP含量；⑤Westem blotting检测胞浆内Cytochrome c和Smac/DIABLO蛋白含量；⑥试剂盒检测caspase3,9酶活性。研究结果如下：(一)PXR受体途径相关基因、蛋白及酶活性①MEHP处理L02细胞24h,除6.25μM组外,其他处理组pxr基因的mRNA表达均被上调(p<0.05或p<0.01)。在36h时点,所有处理组pxr基因的mRNA表达均被上调(p<0.05或p<0.01)。MEHP处理HepG2细胞24h,在>25.00μM的各处理组pxr基因mRNA表达均被上调(p<0.05或p<0.01)。在3.6h时点,除6.25μM处理组外,其他处理组pxr基因mRNA表达均被上调(p<0.01)。②MEHP处理L02细胞24h,50.00μM和100.00μM处理组CYP3A4蛋白表达量增加p<0.01)。在36h时点,除6.25μM处理组外,其他处理组CYP3A4蛋白表达量均增加(p<0.05或p<0.01)。MEHP处理HepG2细胞24h,除6.25μM处理组外,其他处理组CYP3A4蛋白表达量增加(p<0.05或p<0.01)。在36h时点,>25.00μM的各处理组CYP3A4蛋白表达均增加(p<0.01);③MEHP处理L02细胞24h,50.00μM和100.00gM处理组ECOD酶活性均显著性升高(p<0.05或p<0.01)；在36h时点,≥25.00μM的各处理组ECOD活性均显著性升高(p<0.01)。 MEHP处理HepG2细胞24h和36h,所有处理组ECOD活性均显著性升高(p<0.05或p<0.01)。(二)细胞凋亡相关蛋白的表达水平①MEHP处理L02细胞36h,检出50.00μM和100.00μM处理组MDM2蛋白表达的下调(p<0.05)；除6.25μM处理组外,其他处理组p53及其磷酸化蛋白均被上调(p<0.05或p<0.01)o p53/MDM2比值从12.50μM处理组开始即被上调(p<0.01)。在≥25.00μM的各处理组均检出Bax蛋白表达上调(p<0.01),但Bcl-2蛋白在50.00μM和100.00μM处理组则下调p<0.05或p<0.01)。所有处理组的Bax/Bcl-2比值均升高p<0.05或p<0.01)o PUMA和NOXA蛋白表达在≥25.00μM的各处理组均被上调(p<0.05或p<0.01)。②MEHP处理HepG2细胞36h,仅在100μM处理组检出MDM2蛋白表达下调(p<0.05),而在所有处理组的p53蛋白表达则检出上调(p<0.05或p<0.01),在≥25.00μM的各MEHP处理组均检出磷酸化p53蛋白表达上调(p<0.01)。所有处理组的p53/MDM2比值均被上调(p<0.01)。仅在100.00μM处理组检出Bax蛋白表达上调(p<0.05),但在100.00μM处理组则检出Bcl-2蛋白表达下调(p<0.05)。除6.25μM组外,其他处理组均检出Bax/Bcl-2比值的升高(p<0.05或p<0.01)。在≥12.50μM的各MEHP处理组均检出PUMA和NOXA蛋白表达上调(p<0.05或p<0.01)。(三)细胞线粒体损伤指标①MEHP处理L02细胞24h,除6.25μM和12.50μM处理组外,其他处理组的ATP含量均显著性降低(p<0.05或p<0.01)。在36h时点,50.00μM和100.00μM处理组ATP含量也显著性降低(p<0.01)。MEHP处理HepG2细胞24h和36h,除36h时点的6.25μM处理组外,其他处理组的ATP含量均显著性降低(p<0.01)。②MEHP处理L02细胞36h,所有MEHP处理组的胞浆中细胞色素C(Cytochrome c)的含量均显著性升高(p<0.01)。除6.25μM和12.50μM处理组外,其他处理组胞浆中Smac/DIABLO的含量均显著性升高(p<0.05或p<0.01)。MEHP处理HepG2细胞36h,除6.25μM处理组外,其他处理组胞浆中Cytochrome c的含量均升高(p<0.05或p<0.01),并在所有处理组中均检出胞浆中Smac/DIABLO的含量的升高(p<0.01)。(四)Caspase3,9酶活性①MEHP处理L02细胞36h,在≥25.00μM各处理组的Caspase3和9酶活性均显著性升高(p<0.05或p<0.01)。②MEHP处理HepG2细胞36h,除6.25μM处理组外,其他处理组的Caspase3和9酶活性均显著性升高(p<0.05或p<0.01)。结论:MEHP上调L02细胞和HepG2细胞pxr基因的mRNA表达水平,诱导CYP3A4蛋白表达量及其酶活性的增加；诱导p53和促凋亡蛋白(Bax、 NOXA、 PUMA)上调,以及MDM2和Bcl-2蛋白的下调,并激活了线粒体凋亡通路。第三部分Fas/FasL在p53非依赖性信号通路调控MEHP致肝细胞凋亡中的作用第二部分的研究结果显示：p53介导了线粒体通路调控MEHP致肝细胞的凋亡。目的：采用RNA干扰技术沉默p53,探索性研究p53非依赖性信号通路在MEHP致L02细胞和HepG2细胞凋亡中的调控作用。方法：MEHP设定浓度为50.00μM和100.00μM,二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照(终浓度≤0.1%),检测内容包括：检测细胞凋亡率、测定p53、 p-p53、 MDM2、 Bax. Bcl-2、 PUMA、 NOXA、 Fas和FasL蛋白的表达水平、胞浆中Cytochrome c和Smac/DIABLO蛋白含量、以及Caspase3,8,9酶活性。研究结果如下：(一)L02细胞和HepG2细胞p53基因沉默效率①用RNA干扰L02细胞p53基因24h后,用qRT-PCR技术检测显示：p53mRNA表达量相对于阴性对照组的表达量降低83.1%,在处理48h后,p53蛋白表达降低52.5%。②用RNA干扰HepG2细胞p53基因24h后,P53mRNA表达量相对于阴性对照组表达量降低81.4%；在处理48h后,p53蛋白表达降低52.4%。(二)细胞凋亡①MEHP处理L02细胞和L02-P53细胞36h,与各自对照组相比,细胞凋亡率均显著性升高(p<0.01)。在相同MEHP处理浓度下,L02-p53细胞凋亡率与L02细胞相比均显著性升高(p<0.01)。②MEHP处理HepG2和HepG2-p53细胞36h,与各自对照组相比,细胞凋亡率均显著性升高(p<0.01)。在相同MEHP处理浓度下,HepG2-p53细胞凋亡率与HepG2细胞相比均显著性升高p<0.01)。(三)细胞凋亡相关蛋白①MEHP处理L02细胞36h,各处理组与对照组相比,p53、p-p53、Bax、PUMA、 NOXA、Fas和FasL蛋白表达均上调p<0.01),但MDM2和Bcl-2蛋白表达均下调(p<0.01)。MEHP处理L02-p53细胞36h,各处理组与对照组相比,MDM2、Bax、PUMA、 NOXA、 Fas和FasL蛋白表达均上调(p<0.01), p53、p-p53和Bcl-2蛋白表达均下调。同一浓度MEHP处理的L02-p53细胞和L02细胞的结果比较显示：L02-p53细胞的MDM2、Fas和FasL蛋白表达均明显上调p<0.01),而p53和p-p53蛋白则明显下调(p<0.01),但未检出Bax、Bcl-2、PUMA和NOXA蛋白表达量的变化(p>0.05)。②MEHP处理HepG2细胞36h,各处理组与对照组相比,p53、p-p53、Bax、PUMA、 NOXA、Fas和FasL蛋白表达均上调p<0.01),但MDM2和Bcl-2蛋白表达均下调(p<0.01)。 MEHP处理HepG2-p53细胞36h,各处理组与对照组相比,Bax、PUMA、 NOXA、Fas和FasL蛋白表达均上调(p<0.01), Bcl-2蛋白表达均下调；未检测到p53、p-p53和MDM2蛋白表达的改变(p>0.05)。同一浓度MEHP处理HepG2-p53细胞和HepG2细胞的结果比较显示：HepG2-p53细胞的MDM2、Fas和FasL蛋白表达均明显上调p<0.01),p53和p-p53蛋白表达明显下调p<0.01),但均未检出Bax、Bcl-2、PUMA和NOXA蛋白表达量的变化(p>0.05)。(四)胞浆中Cytochrome c和Smac/DIABLO含量①MEHP处理L02细胞和L02-p53细胞36h,各处理组与各自对照组相比,胞浆中Cytochrome c含量均显著性升高p<0.01),仅在100.00μM处理组检出Smac/DIABLO蛋白表达上调(p<0.01)。②MEHP处理HepG2细胞和HePg2-P53细胞36h,各处理组与各种对照组相比,仅在100.00μM处理组检出胞浆Cytochrome c含量显著性升高p<0.01),在所有处理组检出Smac/DIABLO蛋白表达上调p<0.05或p<0.01)。(五)Caspase3,8,9酶活性MEHP处理L02细胞、HepG2细胞、L02-p53细胞和HepG2-p53细胞36h,各处理组与各自对照组相比,Caspase3,8,9酶活性均显著性升高p<0.01)。同一浓度MEHP处理L02-P53细胞和L02细胞以及HepG2-p53细胞和HepG2细胞的结果比较显示：L02-P53细胞和HepG2-p53细胞各处理组的Caspase3,8,9酶活性均诱导性升高(p<0.05或p<0.01)。结论：在MEHP致L02细胞和HepG2细胞凋亡中,p53蛋白介导的细胞信号通路并非为其唯一的调控机制,Fas/FasL通路可代偿p53介导的线粒体通路参与细胞凋亡的调控。创新点：1.发现p53介导的线粒体凋亡通路参与了MEHP致人肝细胞凋亡的调控。2.发现Fas/FasL凋亡通路可部分代偿p53介导的线粒体通路参与MEHP致人肝细胞凋亡的调控。

全文目录


英文缩写词汇表  6-8
摘要  8-16
Abstract  16-25
前言  25-30
第一部分 MEHP致人肝细胞氧化性DNA损伤和细胞凋亡的研究  30-54
  一、材料和方法  30-40
  二、结果  40-51
  三、讨论  51-54
第二部分 p53介导线粒体通路在MEHP致肝细胞凋亡中的调控作用  54-81
  一、材料和方法  54-63
  二、结果  63-78
  三、讨论  78-81
第三部分 Fas/FasL在p53非依赖性信号通路调控MEHP致肝细胞 #76凋亡中的作用  81-103
  一、材料和方法  81-83
  二、结果  83-100
  三、讨论  100-103
小结  103-104
参考文献  104-131
博士在读期间参与的科研项目  131
博士在读期间发表论文  131-133
致谢  133

相似论文

  1. Slug对P53-MDM2系统的调控作用,R730.2
  2. 西施舌精子冷冻保存及其冷冻损伤机理研究,S968.3
  3. CADPE抗肿瘤作用及对胃癌细胞凋亡的影响,R735.2
  4. 甜菜夜蛾信息素结合蛋白的表达动态及其受交配和钟基因沉默的影响,S433.4
  5. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
  6. 醋酸铅对鲤鱼卵巢上皮细胞毒性的研究,X174
  7. 马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因的克隆、表达分析及其dsRNA的发酵生产,S435.32
  8. 几种新型杀虫剂对马铃薯甲虫的毒力及两类靶标的分子克隆,S435.32
  9. 地克珠利对柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子甘油醛-3-磷酸脱氢酶的影响,S858.31
  10. PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞钙信号的影响及其机理初探,S858.28
  11. β-catenin在猪卵巢组织中的表达以及对猪卵巢颗粒细胞凋亡及类固醇生成酶的影响,S828
  12. 伏马菌素B1和黄曲霉毒素B1联合诱导Vero细胞凋亡的研究,S856.9
  13. 黄曲霉毒素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导锦鲤原代肝细胞凋亡机制的初步研究,S856.9
  14. 沉默BMPR-IB基因对猪卵巢颗粒细胞凋亡及BMP通路相关基因表达的影响,S828
  15. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇对鸡软骨细胞增殖、分化及凋亡的影响,S858.31
  16. 慢病毒载体介导的RNAi特异性沉默猪Myostatin基因的研究,S828
  17. Foxol对小鼠颗粒细胞凋亡的影响,S865.13
  18. 骨髓间充质干细胞预移植1周对大鼠心肌缺血再灌损伤的修复作用,R542.22
  19. MCFP对肝癌细胞生物行为学影响初步研究,R735.7
  20. 18氟—氟代脱氧葡萄糖诱导Eca-109食管癌细胞凋亡的初步研究,R735.1
  21. KZNF家族中p53调控分子的筛选及功能鉴定（AxZ型、SABZ型和ACxZ型）,R730.2

中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 劳动卫生 > 劳动生理学
© 2012 www.xueweilunwen.com