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草鱼呼肠孤病毒（GCRV096）VP6和NS38蛋白的免疫原性及其相互作用蛋白的筛选

作　者: 李杰
导　师: 丁燏
学　校: 广东海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: GCRV096 VP6 NS38 免疫原性酵母双杂交相互作用蛋白
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

草鱼出血病发病率高、流行范围广，且缺乏有效的防治药物，是草鱼养殖发展中的瓶颈问题。草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)是草鱼出血病的主要病原，主要危害草鱼鱼种，严重影响着我国淡水渔业的发展。实践证明,免疫预防是预防该病最为有效的方法之一。但是，GCRV与其它的鱼类呼肠孤病毒之间无交叉抗原，且不同病毒株之间也存在着抗原性差异。有研究表明VP6蛋白诱导中和抗体效价较高，NS38蛋白诱导的中和抗体效价次之。进一步了解VP6和NS38蛋白的免疫原性有助于完善草鱼出血病的免疫预防方法。病毒入侵宿主后，在宿主细胞内大量繁殖，使细胞发生病变，致使宿主发病死亡。深入了解GCRV的侵染机制，找到与病毒蛋白相互作用的宿主蛋白，对病害的防治具有指导作用。本实验以草鱼呼肠孤病毒株096（GCRV096）为研究对象，克隆表达VP6和NS38基因，研究VP6和NS38蛋白的免疫原性；应用酵母双杂交系统筛选与GCRV096VP6和NS38蛋白相互作用的宿主蛋白。克隆VP6和NS38基因，分别构建原核表达质粒pET28a-VP6及pET28a-NS38，然后导入大肠杆菌BL21（DE3）进行表达，纯化目的蛋白。用纯化的目的蛋白分别与CIK细胞孵育12h、24h、48h，然后对CIK细胞进行病毒感染13h，荧光定量分析不同时间CIK细胞中VP6及NS38基因的表达量。实验结果表明，VP6和NS38蛋白引发CIK细胞免疫效应的强度随孵育时间的增长而增强，48h时免疫效应最好，VP6蛋白表现的更为明显。用GCRV096感染CIK细胞（蛋白孵育48h）4h、8h、13h，荧光定量分析结果表明，孵育8h时VP6蛋白引发的免疫效应最强，而NS38蛋白是4h。分别将VP6和NS38基因克隆到诱饵载体pGBKT7，构建诱饵质粒pGBKT7-VP6及pGBKT7-NS38，转化酵母菌株Y2HGold，并对诱饵质粒进行自激活作用及毒性检测，结果表明诱饵质粒构建成功。利用SMART技术构建了草鱼肾脏细胞（CIK）的全长cDNA文库，其文库容量为2.4×106，文库滴度为6.44×107cfu/mL。将含有诱饵质粒的Y2HGold菌株与含有文库质粒的Y187菌株相融合，按照MatchmarkerTMGoldYeast Two-Hybrid System操作手册筛选阳性克隆，通过高选择性培养基确定阳性克隆；提取阳性克隆的酵母质粒，再转化大肠杆菌并提纯质粒DNA，将其与诱饵质粒共转化酵母菌株Y2HGold，确定相互作用，并对阳性克隆中插入的cDNA进行测序分析。在VP6相互作用蛋白的筛选中得到4株阳性克隆，经比对分析得到两种与其相互作用的蛋白，其中一种与glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）高度同源，另一种未找到典型的同源蛋白；而NS38蛋白得到3株阳性克隆，经比对分析得到两种与其相互作用的蛋白，其中一种与40S核糖体蛋白S16亚基高度同源，另一种未找到典型的同源蛋白。本论文对GCRV096VP6和NS38蛋白的免疫原性进行了研究，为草鱼出血病的免疫防治研究提供了理论依据；并利用酵母双杂交系统筛选出与VP6和NS38蛋白相互作用的宿主蛋白，为进一步研究VP6与NS38蛋白的生物学功能奠定了基础，对探讨GCRV的侵染机制具有重要意义。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-12
1 文献综述  12-21
  1.1 草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)  12-16
    1.1.1 GCRV 的发现和危害  12-13
    1.1.2 GCRV 形态和基因组结构  13
    1.1.3 GCRV 流行病学  13-14
    1.1.4 GCRV 特性及检测  14
    1.1.5 GCRV 基因编码蛋白的功能  14-15
    1.1.6 草鱼出血病的预防和治疗  15-16
  1.2 酵母双杂交系统的研究进展  16-20
    1.2.1 酵母双杂交系统的基本原理  17-18
    1.2.2 酵母双杂交系统的应用  18-19
    1.2.3 酵母双杂交系统的优点及局限性  19-20
  1.3 本文研究的目的意义  20-21
2 GCRV096 VP6 蛋白免疫原性研究  21-32
  2.1 材料  21-24
    2.1.1 病毒株和细胞系  21
    2.1.2 质粒载体和受体菌株  21
    2.1.3 主要试剂及溶液  21-23
    2.1.4 主要仪器  23-24
  2.2 方法  24-29
    2.2.1 VP6 基因的克隆  24
    2.2.2 VP6 基因的原核表达  24-27
    2.2.3 VP6 蛋白免疫原性的研究  27-29
  2.3 结果  29-31
    2.3.1 VP6 基因的克隆及原核表达  29-30
    2.3.2 VP6 蛋白免疫原性研究  30-31
  2.4 讨论  31-32
3 GCRV096 VP6 蛋白相互作用蛋白的筛选  32-51
  3.1 材料  32-37
    3.1.1 病毒株和细胞系  32
    3.1.2 菌株和质粒  32-36
    3.1.3 主要试剂及溶液  36-37
    3.1.4 主要仪器  37
  3.2 方法  37-45
    3.2.1 VP6 基因的克隆  37
    3.2.2 诱饵重组质粒 pGBKT7-VP6 的构建  37-38
    3.2.3 酵母菌的准备及验证  38-39
    3.2.4 诱饵重组载体 pGBKT7-VP6 的表达及自激活检测  39
    3.2.5 pGBKT7-VP6 对酵母菌株的毒性检测  39
    3.2.6 草鱼肾脏细胞（CIK）系 cDNA 文库的构建  39-43
    3.2.7 VP6 蛋白相互作用蛋白的筛选  43-44
    3.2.8 对照实验  44-45
  3.3 结果  45-49
    3.3.1 pGBKT7-VP6 诱饵质粒的构建  45
    3.3.2 pGBKT7-VP6 自激活作用检测和毒性检测  45
    3.3.3 CIK cDNA 文库构建  45-47
    3.3.4 VP6 相互作用蛋白的筛选  47-49
  3.4 讨论  49-51
4 GCRV096 NS38 蛋白免疫原性研究  51-57
  4.1 材料  51
    4.1.1 病毒株和细胞系  51
    4.1.2 质粒载体和受体菌株  51
    4.1.3 主要试剂及溶液  51
    4.1.4 主要仪器  51
  4.2 方法  51-53
    4.2.1 NS38 基因克隆的方法  51
    4.2.2 NS38 基因的原核表达  51-53
    4.2.3 NS38 蛋白免疫原性研究  53
  4.3 结果  53-55
    4.3.1 NS38 基因的克隆及原核表达  53-54
    4.3.2 NS38 蛋白免疫原性研究  54-55
  4.4 讨论  55-57
5 GCRV096 NS38 蛋白相互作用蛋白的筛选  57-62
  5.1 材料  57
    5.1.1 病毒株和细胞系  57
    5.1.2 菌株和质粒  57
    5.1.3 主要试剂及溶液  57
    5.1.4 主要仪器  57
  5.2 方法  57-58
    5.2.1 NS38 基因的克隆  57
    5.2.2 诱饵重组质粒 pGBKT7-NS38 的构建  57
    5.2.3 酵母实验方法  57-58
    5.2.4 诱饵重组载体 pGBKT7-NS38 的表达及自激活检测  58
    5.2.5 pGBKT7-NS38 对酵母菌株的毒性检测  58
    5.2.6 草鱼肾脏细胞（CIK）cDNA 文库的构建  58
    5.2.7 NS38 蛋白相互作用蛋白的筛选  58
    5.2.8 对照实验  58
  5.3 结果  58-60
    5.3.1 pGBKT7-NS38 诱饵质粒的构建  58
    5.3.2 pGBKT7-NS38 自激活作用检测和毒性检测  58-59
    5.3.3 CIK cDNA 文库构建及文库鉴定  59
    5.3.4 NS38 相互作用蛋白的筛选  59-60
  5.4 讨论  60-62
6 结论  62-63
参考文献  63-71
致谢  71-72
作者简历  72-73
导师简介  73

草鱼呼肠孤病毒（GCRV096）VP6和NS38蛋白的免疫原性及其相互作用蛋白的筛选

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