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GATA-5相互作用蛋白的筛选和miR-142-3p在造血过程中的功能研究

作　者: 李海涛
导　师: 贾海波
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 酵母双杂交 GATA-5 SMART cDNA 斑马鱼 miR-142-3p 原位杂交 O-染色
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

(1)目的:通过酵母双杂交系统筛选与GATA-5相互作用的蛋白,为进一步了解GATA-5基因在脊椎动物心脏发育与内脏生成中的功能及作用机制打下基础。方法:使用Trizol试剂从斑马鱼卵(day1,day2)提取总RNA,以其为反转录模板,CDSIII和SMART III为引物进行cDNA第一条链合成,之后通过LD-PCR,获得具有同源臂的SMART cDNA产物;以同源臂为基础,将SMART cDNA文库与Sma1酶线性化的PGADT7-Rec质粒共转化酵母菌株Y187,完成同源重组;将GATA-5克隆到载体PGBKT7-Rec并转入酵母菌株AH109以验证该基因在酵母中的自激活性和细胞毒性;挑选上述两种菌株接合生殖后长出的酵母克隆,经Colony-lift Filter Assay,酵母PCR,序列比对等手段对编码与GATA-5相互作用蛋白的基因片段进行初步研究。结果: SMART cDNA文库构建完毕,经琼脂糖电泳观察,cDNA片段的覆盖范围为250-3000bp.目前筛选出5个可能与GATA-5蛋白相互作用的阳性克隆.结论: SMART cDNA文库的多样性和库容量均符合筛选需求。可用于其他心脏发育相关基因的研究,已筛选得到的蛋白尚需进一步鉴定。(2) MicroRNAs是一类在病毒和真核生物中发现的具有调控功能的内源性非编码单链RNA,长度约为21-23个核苷酸,它们能够与靶基因mRNA的3‘UTR区特异性结合引起该基因mRNA的降解或者抑制蛋白的合成。目前已经有上百种miRNAs在真核生物中被证实,且许多miRNAs在进化上高度保守。据推测miRNAs调控着人类30%的基因,在控制有机体的疾病发生和生长发育方面起着很大的作用。近些年来,模式生物的广泛应用极大地推动了科学研究的进展,本文利用斑马鱼作为模式生物,通过显微注射的方法将miR-142-3p注射到斑马鱼卵,O-染色的结果表明miR-142-3p在斑马鱼胚胎中的过表达减少了红细胞的生成,通过胚胎整体原位杂交,结果表明miR-142-3p的过表达对斑马鱼胚胎发育过程造血干细胞,血管原细胞的分化没有影响,但髓细胞中pu-1 mRNA有所增加。我们推测可能由于miR-142-3p的过表达导致造血干细胞向红系祖细胞的分化减少进而使得红细胞数量减少;同时,增大了造血干细胞朝髓细胞的分化,进而使得髓细胞数量增加。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
1 GATA-5 相互作用蛋白的筛选  8-17
  1.1 GATA 家族成员的研究现状  8-13
  1.2 酵母双杂交技术原理  13-15
  1.3 本课题目的和实验流程  15-17
2 实验材料与方法  17-35
  2.1 实验材料  17-22
  2.2 实验方法  22-35
3 实验结果讨论  35-43
  3.1 实验结果  35-41
  3.2 实验讨论  41-43
4 miR-142-3p 在造血过程中的功能  43-47
  4.1 MicroRNA 的生物合成与作用机制  43-45
  4.2 miR-142-3p 的研究进展  45-47
5 材料和方法  47-52
  5.1 实验材料  47-49
  5.2 实验方法  49-52
6 实验结果与讨论  52-55
  6.1 实验结果  52-54
  6.2 实验讨论  54-55
致谢  55-57
参考文献  57-60

GATA-5相互作用蛋白的筛选和miR-142-3p在造血过程中的功能研究

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