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黑莓花青素苷、原花色素的合成代谢及相关基因克隆和表达研究

作　者: 陈清
导　师: 汤浩茹
学　校: 四川农业大学
专　业: 果树学
关键词: 黑莓 花青素苷 原花色素 基因克隆 表达
分类号: S663.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


黑莓(Blackberry),又称黑刺莓,是悬钩子属(Rubus L.)植物中应用于园艺栽培使用的三大种群之一。黑莓果实含有丰富的花青素苷、原花色素以及微量矿质元素,具有较高的营养价值而风靡欧美,被列为世界第三代水果。其果实提取物的抗癌、消炎以及预防心血管疾病等保健功效显著,在病理学方面得到了广泛研究。但有关黑莓果实内含物,尤其是有关花青素苷以及原花色素的生物合成方面报道甚少。国外的黑莓品种选育主要来源于野生资源的筛选,而我国没有黑莓野生群体分布,主栽品种均引白国外。因此,应用分子生物学手段对引进的黑莓品种进行遗传改良以培育具有自主知识产权的黑莓品种,在我国黑莓育种工作中具有良好的发展前景。本课题从黑莓果实发育过程中的花青素苷和原花色素生理变化入手,克隆获得了类黄酮代谢途径中花青素苷和原花色素分支的6个关键结构基因和控制花青素苷合成的1个转录调节因子基因,并分析了这些基因在黑莓果实发育过程中的表达变化。主要研究内容和结果如下：1分别采用了pH示差法和DMACA化学反应法对黑莓果实发育过程中的花青素苷和原花色素进行测定。结果表明：成熟的黑莓果实中含有丰富的花青素苷(1.426mg-g-1FW)。在果实发育的前期,花青素苷含量较低,而在果实发育的后期,即红色转为黑色过程中花青素苷大量积累。但幼嫩的果实中原花色素含量较高(>40mg-g-1FW),随着果实的成熟,原花色素含量逐渐减少,到果实成熟时原花色素含量达到最低值(4.12mg-g-1FW)。2通过同源克隆的方式获得了黑莓类黄酮代谢的花青素苷和原花色素合成途径中的6个关键结构基因,包括查尔酮合成酶(Rubus Chalcone Synthase, RuCHS, Accession No. JN602374)、二氢黄酮醇4-还原酶(Rubus Dihydroflavonol4-reductase, RuDFR, Accession No. JF764809),无色花青素双加氧酶(也称花青素合成酶)(Rubus Leucoanthocyanidin dioxygenase, RuLDOX/ANS, Accession No. JF764807)、无色花青素还原酶(Rubus Leucoanthocyanidin Reductase, RuLAR, Accession No. JQ068826)和花青素还原酶(Rubus Anthocyanidin Reductase, RuANR, Accession No. JQ068825)以及一个糖基转移酶(Glycosyltransferase) RuGT1(Accession No. JF764808)编码基因。3以黑莓基因组DNA为模板,同源克隆获得了RuMYB10基因片段,通过SON-PCR技术获得了该基因全长编码序列(Full Coding Sequences, CDS);以黑莓果实mRNA为模板,RT-PCR扩增获得了基因全长(Accession No.:JQ359611)。序列分析表明：该基因全长编码区共1837bp,编码216个氨基酸,分子量为24863Da。具有MYB转录因子家族特有的R1R2保守序列。与悬钩子属的欧洲红树莓(Rubus ideaus) RiMYB10相比,两者内含子区变异极大,但氨基酸具有较高的同源性(89.81%)。在RuMYB10基因的两个内含子中,第二个内含子长度为750bp,占全长40.8%；在R3重复单元中存在与bHLH因子互作的’[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R’序列;而促进花青素苷合成的MYB转录因子3个特征氨基酸残基中的丙氨酸(A)被丝氨酸(S)取代。4采用改进的CTAB法获得了黑莓果实高质量RNA,用实时定量PCR技术对各结构基因以及调控基因RuMYB10在黑莓果实发育过程中的表达变化进行分析。结果表明：调控花青素苷合成的结构基因RuANS表达变化与花青素苷合成积累-致,在其果实红色到黑色转色过程中达到最高水平；而原花色素合成途径中的特异基因RuLAR和RuANR在幼果期表达量最高,伴随着原花色素的减少,转录水平也呈下降趋势；而作为类黄酮代谢前期以及中期的结构基因RuCHS和RuDFR,其前期有一个转录增加的过程,到果实变红之前达到最大值；而后转录水平逐渐降低,直到花青素苷大量积累的果实变黑阶段又有一个转录增加的过程。作为花青素苷合成代谢的特异调控因子,RuMYB10基因表达模式与RuANS基因类似,在花青素积累高峰来临之前达到最高表达量,从而验证了该因子调控作用的特异性。相关性分析表明,RuANS是黑莓花青素苷合成途径中的特异酶,而相对于RuANR, RuLAR和黑莓原花色素的积累关系更为密切。5采用简并引物扩增所获得的RuGT糖基转移酶可能是一个原花色素合成相关的糖基转移酶(Glycosyltransferases, GTs)家族成员。同已报道的其他类黄酮糖基转移酶具有较高的同源性。其转录水平在幼果期最高,随着果实的发育而逐渐降低,直到果实大量积累花青素苷时才有小幅回升。此模式与以往报道的类黄酮糖基转移酶截然不同,而与新近报道的原花色素特异糖基转移酶基因(?)JGT72L1表达模式类似。其底物特异性及酶促动力学特征正在作进一步研究。

全文目录


摘要  3-6
ABSTRACT  6-9
缩略词表  9-11
目录  11-14
第一章 课题提出与前人研究进展  14-30
  1 悬钩子属植物分类与地理分布  14-16
  2 黑莓的产业发展现状  16
  3 黑莓的营养价值及经济价值  16-17
  4 黑莓育种中急需解决的几个问题  17-19
  5 植物类黄酮生物合成研究进展及存在的问题  19-28
    5.1 花青素苷和原花色素的生物合成、转运和存储  21-25
    5.2 植物花青素苷、原花色素代谢的转录调控  25-28
      5.2.1 转录因子对合成途径中结构基因的影响  26-27
      5.2.2 独立作用与协同效应  27-28
  6 本课题的目标与意义  28-30
第二章 黑莓果实发育过程中花青素苷与原花色素的代谢变化  30-40
  1 材料与方法  30-32
    1.1 试验材料  30-31
    1.2 试验方法  31-32
      1.2.1 花青素苷的提取与定量  31-32
      1.2.2 原花色素的提取与定量  32
    1.3 数据统计  32
  2 结果与分析  32-36
    2.1 黑莓果实纵横径及单果重变化  32-33
    2.2 黑莓果实成熟过程中花青素苷的代谢变化  33-34
    2.3 黑莓果实发育过程中原花色素的代谢变化  34-36
  3 讨论  36-40
    3.1 果实生长曲线  36
    3.2 栽培管理  36-37
    3.3 花青素苷与原花色素的测定  37-40
第三章 花青素苷合成中调控因子RUMYB10基因的全长克隆,序列分析及表达  40-54
  1 材料与方法  40-44
    1.1 植物材料  40
    1.2 工程菌株  40-41
    1.3 载体  41
    1.4 主要试验方法  41-44
      1.4.1 DNA的提取及质量检测  41-42
      1.4.2 引物设计与片段扩增  42
      1.4.3 SON-PCR侧翼序列扩增  42-43
      1.4.5 PCR产物的回收、连接、转化及测序后的数据分析  43
      1.4.6 实时定量PCR检测基因表达水平  43-44
  2 结果与分析  44-51
    2.1 RuMFB10的全长扩增  44
    2.2 RuMYB10基因序列分析  44-45
    2.3 RuMYB10基因的RT-PCR验证  45-46
    2.4 RuMYB10转录因子结构分析  46-48
    2.5 RuMYB10功能相近转录因子的系统发育分析  48-50
    2.6 RuMYB10的三级结构预测  50
    2.7 RuMYB10在黑莓果实发育过程中的表达  50-51
  3 讨论  51-54
第四章 黑莓花青素苷和原花色素生物合成结构基因的克隆及表达  54-81
  1 材料与方法  54-61
    1.1 基因组DNA和果实总RNA的提取  54-56
      1.1.1 基因组DNA提取及质量检测  55
      1.1.2 RNA提取及检测  55-56
    1.2 引物设计及合成  56
    1.3 PCR扩增反应程序及体系  56-57
    1.4 PCR产物回收  57
    1.5 感受态细胞制备  57-58
    1.6 产物与载体的连接及转化  58
    1.7 重组质粒鉴定  58-59
    1.8 cDNA第一链合成  59
    1.9 实时定量PCR程序及体系  59-60
    1.10 数据处理  60-61
      1.10.1 核酸序列分析  60-61
      1.10.2 定量数据分析  61
  2 结果与分析  61-73
    2.1 DNA提取及检测  61-62
    2.2 RNA提取及检测  62-64
    2.3 各基因生物信息学分析  64-68
    2.4 结构基因表达模式  68-73
      2.4.1 标准曲线的构建  69-70
      2.4.2 六个结构基因在黑莓果实发育过程中表达及聚类模式  70-72
      2.4.3 基因的表达与产物积累的相关性分析  72-73
  3 讨论  73-81
    3.1 黑莓果实RNA的提取  73-75
    3.2 基于基因同源序列的PCR扩增策略  75-76
    3.3 黑莓编码基因中密码子偏好性  76-77
    3.4 类黄酮代谢结构基因的表达与花青素苷、原花色素积累的关系  77-79
    3.5 潜在的特殊功能的糖基转移酶基因RuGT  79-81
第五章 需进一步研究的内容  81-83
参考文献 LITERATURE CITED  83-99
附录  99-101
致谢  101-102
学习期间发表论文情况  102-103

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 浆果类 > 悬钩子（黑莓）
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