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S-生物丙烯菊酯免疫分析方法研究

作　者: 曹猛猛
导　师: 王鸣华
学　校: 南京农业大学
专　业: 农药学
关键词: S-生物丙烯菊酯半抗原多克隆抗体 ELISA ECL-ELISA 立体选择性
分类号: S482.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目前,世界上使用的农药中手性农药的比例达到了25%,而拟除虫菊酯类杀虫剂中几乎所有的农药都是手性农药。同一手性农药的各个对映异构体间不仅对靶标生物的杀虫除草杀菌活性具有对映体选择性,而且对非靶标生物也会产生对映体选择性的毒性。为了降低农药的使用量和保护环境免受侵害,对手性农药进行检测方法的研究则显得十分有必要。免疫分析技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便、适宜现场监控和同时筛选大量样品等优点,在农药残留快速检测中发挥着重要的作用。本研究以菊酯类杀虫剂S-生物丙烯菊酯为研究对象,建立了s-生物丙烯菊酯的间接竞争ELISA法和ECL-ELISA法,并应用于环境样品中s-生物丙烯菊酯残留检测。设计合成s-生物丙烯菊酯半抗原,将半抗原分别与牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联制备免疫原和包被原,成功建立了基于多克隆抗体的s-生物丙烯菊酯的酶联免疫分析方法。经紫外光谱分析证明成功合成了免疫和包被用人工抗原,S-生物丙烯菊酯免疫原和包被原的结合比分别为32：1和10：1。用免疫抗原免疫雄性新西兰大白兔,获得相应的多克隆抗体,用间接非竞争酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定S-生物丙烯菊酯抗体的效价达到8×105。通过方阵滴定法筛选包被抗原和抗体的最适工作浓度,进一步研究有机溶剂、离子强度和pH值在间接竞争ELISA （ic-ELISA）中对抗体亲和作用的影响,确立了s-生物丙烯菊酯间接竞争酶联免疫分析方法的最佳检测条件为：40%甲醇、0.5mol/L Na+、pH6.5.在最优条件下,建立了S-生物丙烯菊酯的ic-ELISA方法的标准曲线。除与ES-生物丙烯菊酯、富右旋丙烯菊酯和丙烯菊酯有交叉反应外,与大部分菊酯类农药没有明显的交叉反应,表明抗体具有很高的立体选择性。该方法的抑制中浓度IC50为0.089mg/L,最低检测限（IC₁0）为0.0025mg/L。通过采用增强化学发光酶免疫分析（ECL-ELISA）手段,IC50在此基础上又降低了3.56倍,达到0.025mg/L,最低检测限（IC₁0）降低了2.5倍,达到0.001mg/L。以建立的ic-ELISA和ECL-ELISA分析方法,进行了自来水、河水、蒸馏水和尘土的添加回收率试验,添加浓度分别为为0.05mg/L （mg/kg）-0.5mg/L （mg/kg）,0.01mg/L （mg/kg）-0.1mg/L （mg/kg）,添加回收率分别为90.7%-111.7%,78.9%-100.7%,变异系数分别为1.2%-6.5%,1.2%-3.9%。用气相色谱验证ic-ELISA和ECL-ELISA检测的结果。结果显示两种检测方法与GC有很好的相关性（R2=0.9882,0.998）。基于多克隆抗体的ic-ELISA和ECL-ELISA可以高灵敏、快速便捷和低成本的应用于环境样品中S-生物丙烯菊酯残留物的检测。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略语  11-12
第一章文献综述  12-38
  1 拟除虫菊酯农药概述  12
  2 拟除虫菊酯农药残留及其代谢  12-18
    2.1 农药残留的概念  12-13
    2.2 拟除虫菊酯农药的残留  13
    2.3 拟除虫菊酯类农药代谢途径  13-14
    2.4 拟除虫菊酯类农药残留样品前处理方法  14-16
    2.5 拟除虫菊酯类农药残留检测方法  16-18
  3 免疫分析技术  18-26
    3.1 免疫分析技术研究发展历史  18-19
    3.2 免疫分析主要类型  19-21
    3.3 酶联免疫分析方法技术要点  21-26
  4 ELISA检测方法在菊酯类农药中的应用  26-33
    4.1 半抗原的合成  26-31
    4.2 拟除虫菊酯类农药立体选择性酶联免疫分析技术研究  31-33
  5 化学发光免疫测定  33-35
    5.1 化学发光免疫分析基本原理  33
    5.2 化学发光免疫分析方法的主要类型  33-34
    5.3 发光免疫分析方法在农药残留检测方面的应用  34-35
  6 丙烯菊酯介绍  35-36
  7 本研究的目的和意义  36-38
第二章 S-生物丙烯菊酯人工抗原的合成和抗体制备  38-46
  1 试验材料  38-39
    1.1 试验试剂  38
    1.2 缓冲溶液  38
    1.3 试验仪器  38-39
  2 试验方法  39-42
    2.1 半抗原的合成  39
    2.2 人工抗原的制备与鉴定  39-40
    2.3 人工抗原的结合比计算  40
    2.4 免疫方案  40-41
    2.5 采血和试血  41
    2.6 抗体纯化  41
    2.7 抗体效价测定  41-42
  3 结果与分析  42-46
    3.1 半抗原分子的结构鉴定  42-44
    3.2 人工抗原的鉴定及偶联比的测定  44
    3.3 抗体效价的测定  44-46
第三章基于多克隆抗体的S-生物丙烯菊酯ELISA和ECL-ELISA分析方法研究  46-66
  1 试验材料  46-47
    1.1 试验试剂  46
    1.2 缓冲溶液  46
    1.3 试验仪器  46-47
  2 试验方法  47-51
    2.1 酶联免疫吸附分析(ELISA)方法的研究  47-49
      2.1.1 工作浓度选择  47
      2.1.2 间接竞争ELISA(ic-ELISA)程序  47-48
      2.1.3 条件优化  48
      2.1.4 标准曲线的建立和线性范围的考察  48
      2.1.5 精密度测定  48-49
      2.1.6 交叉反应  49
      2.1.7 添加回收率的测定  49
    2.2 增强化学发光酶免疫分析(ECL-ELISA)方法的研究  49-51
      2.2.1 ECL-ELISA检测方法步骤  49-50
      2.2.2 ECL-ELISA方法的优化  50
      2.2.3 ECL-ELISA方法标准曲线的绘制  50
      2.2.4 添加回收率的测定  50-51
    2.3 仪器分析法确证  51
      2.3.1 气相色谱分析条件及标准曲线建立  51
      2.3.2 GC法验证ELISA和ECL-ELISA  51
  3 结果与分析  51-66
    3.1 酶联免疫吸附分析(ELISA)方法的建立  51-57
      3.1.1 工作浓度选定  51-52
      3.1.2 ic-ELISA分析条件的优化  52-53
      3.1.3 标准曲线的建立  53-54
      3.1.4 方法精密度分析  54
      3.1.5 抗体特异性分析  54-55
      3.1.6 添加回收率的测定  55-57
    3.2 增强化学发光酶免疫分析(ECL-ELISA)方法的建立  57-62
      3.2.1 条件优化  58-59
      3.2.2 S-生物丙烯菊酯ECL-ELISA标准曲线的绘制  59-60
      3.2.3 添加回收率的测定  60-62
    3.3 仪器方法确认  62-66
      3.3.1 GC法验证ELISA  62-63
      3.3.2 GC法验证ECL-ELISA  63-66
第四章全文讨论  66-70
  1 人工抗原合成  66
  2 分析条件对ELISA测定的影响  66-67
  3 ELISA精密度分析  67
  4 特异性分析  67-68
  5 添加回收率与ELISA和GC检测方法的比较  68
  6 ECL-ELISA法的建立  68
  7 ELISA法和ECL-ELISA法比较  68-70
第五章全文结论  70-72
  1 全文总结  70-71
  2 不足与展望  71
  3 本论文创新点  71-72
参考文献  72-82
附录  82-84
致谢  84-86
攻读硕士学位期间发表的论文  86

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