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几种水产养殖动物病原快速检测方法的研究

作　者: 丁文超
导　师: 李明云
学　校: 宁波大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 环介导恒温扩增技术溶藻弧菌鳗弧菌传染性脾肾坏死病毒对虾白斑症病毒 ELISA
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)和对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是4种重要的水产养殖病原,其发病的养殖品种多、时间长、区域广,对水产养殖业的发展影响重大。因此,迫切需要建立相应的快速实用的检测技术。PCR扩增得到溶藻弧菌的外膜蛋白基因OmpK,构建了重组表达质粒pET28a-OmpK,诱导表达并纯化蛋白,免疫小鼠制备外膜蛋白OmpK的多克隆抗体,建立了检测溶藻弧菌的酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)。其最低检测极限为104 CFU/ mL,检测特异性较好,为进一步建立简单快速的溶藻弧菌免疫学检测方法奠定基础。环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)由日本学者Notomi等(2000年)提出,是一种新型核酸检测方法。根据溶藻弧菌OmpK基因序列,设计4条LAMP引物,通过条件优化,成功建立了溶藻弧菌的LAMP检测法。该方法确定的扩增条件为65℃反应60 min,琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带,能特异性检出致病性溶藻弧菌,其检测下限比PCR法低一个数量级,相当于38 CFU/ mL。根据鳗弧菌的金属蛋白酶empA基因序列设计3对LAMP引物及FITC标记的探针,结合生物素标记的LAMP扩增(63℃)和横向流动试纸(LFD)产物检测,建立了针对鳗弧菌的LAMP-LFD检测法。LFD检测过程中的探针与扩增产物特异性杂交进一步提高了其的灵敏度和特异性。应用LAMP-LFD法检测时间大约30min,检测灵敏度为7.7 CFU/ mL,而且能从细菌侵染的香鱼肾、肝、脾、肌肉等组织中特异性检测鳗弧菌。通过PCR扩增得到ISKNV的DNA聚合酶基因并克隆测序,根据测序结果设计LAMP引物及探针,建立了ISKNV的LAMP-LFD检测法。其检测极限大约10个拷贝,灵敏度分别是LAMP-AGE和PCR-AGE灵敏度的10倍和1000倍。根据WSSV的结构蛋白VP26基因设计引物,建立WSSV的LAMP检测法,其确定的扩增条件为65℃反应60 min,检测灵敏度比常规PCR法高一个数量级,扩增结果借助SYBR Green I荧光染料进行肉眼观察,实现了检测的一步完成。本研究所建立4种重要水产动物致病微生物的LAMP诊断方法,与常规PCR相比灵敏度相当甚至更高,而检测时间大大缩短;反应仅需一个水浴锅就可进行,节省了成本、操作简单,更适于现场检测及基层普及应用,为进一步开发相应的商业试剂盒提供了理论和技术依据,有望成为其快速检测的常规手段。

几种水产养殖动物病原快速检测方法的研究

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