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重金属Pb~（2+）的抗原合成及其单克隆抗体的制备

作　者: 张志强
导　师: 杨志强
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: Pb2+ 抗原合成 间接竞争ELISA 单克隆抗体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 49次
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内容摘要


随着人们生活水平的不断提高和环保意识的增强,对重金属污染尤为关注,残留检测急需加强。近年来,重金属污染导致中毒事件报道较多,铅尤为突出。机体长时间摄入过量的铅会导致免疫机能下降,诱发多种疾病,儿童铅中毒会严重影响智商发育,也可导致生殖系统发育不良。本研究利用鳌合剂螯合Pb2+,偶联载体蛋白的特性,在体外合成Pb2+免疫抗原,并对其进行鉴定和评估,通过动物免疫,得到抗体;然后利用单克隆抗体制备技术初步建立铅离子的ELISA检测方法;为重金属的残留检测提供一种简便、快捷、特异性高的新技术。结果:（1）当DTPA分别与KLH、BSA偶联并络合Pb2+后,其紫外吸收图谱与载体蛋白KLH、BSA相比,吸收曲线发生了改变,在接近280nm处有最大吸收峰,且最大吸收峰位置吸光值有所增加,说明抗原合成成功。（2）通过石墨炉原子吸收法检测,检测抗原中Pb2+的浓度为115.2μg/mL,偶合率达到77.84%直接说明抗原合成成功;（3）Pb2+以200μg/只剂量免疫小鼠后,抗血清效价明显高于50、100μg/只剂量免疫的小鼠,5免后抗血清效价均在1:128000以上;（4）用BSA-DTPA-Pb和BSA-DTPA检测细胞上清,筛选出了2孔阳性杂交瘤细胞1C7和3H12,阳性率为0.27%;经3次阳性率100%的克隆后只获得了抗Pb2+的杂交瘤细胞株3H12。（5）利用已建立的间接竞争ELISA法检测发现,3H12细胞上清效价在1:1 024以上,腹水效价高于1:256 000。（6）腹水蛋白浓度为12.14 mg/mL,单克隆抗体为IgG1。结论:（1）DTPA可以用于重金属Pb2+免疫抗原、检测抗原合成时的螯合剂。（2）抗原中重金属Pb2+的偶合率为77.84%,直接说明抗原合成成功。（3）合理的免疫方案有助于产生高效价的抗血清,免疫后血清效价均在128000以上,达到了预期的效果。（4）虽已制备出抗Pb2+的单克隆抗体,但融合率较低,克隆不够稳定,抗原合成工艺尚需进一步优化。

全文目录


摘要  2-3
Summary  3-5
中英文缩略词  5-9
第一部分 文章综述  9-21
  前言  9
  1. 重金属的危害  9-15
    1.1 重金属对环境的影响  9-12
    1.2 重金属对生物的影响  12-13
    1.3 重金属对植物和动物饲料的影响  13-15
  2. 重金属检测研究进展  15-16
    2.1 原子吸收光谱法在重金属检测中的应用  15
    2.2 原子荧光光谱法在重金属检测中的应用  15
    2.3 电感耦合等离子体质谱法和发射光谱法在重金属检测中的应用  15-16
  3 免疫学技术在残留检测中的应用  16-17
  4 单克隆技术在残留检测中的应用和意义  17-19
    4.1 单克隆抗体技术原理  17
    4.2 单克隆抗体的制备流程  17-19
    4.3 单克隆抗体在残留检测上的应用  19
  5 研究目的和意义  19-21
第二部分 试验部分  21-58
  第一章 重金属Pb~(2+)抗原的合成与评估  21-29
    1 材料  21
      1.1 试剂  21
      1.2 仪器  21
    2 方法  21-23
      2.1 抗原制备  21-22
      2.2 抗原的鉴定  22-23
    3 结果  23-25
      3.1 抗原蛋白浓度  23-24
      3.2 抗原结构特性紫外分析  24
      3.3 抗原游离氨基浓度  24-25
      3.4 抗原中Pb~(2+)含量的测定  25
    4 讨论  25-29
      4.1 完全抗原的影响因素  25-27
      4.2 完全抗原鉴定  27-29
  第二章 动物免疫以及间接ELISA方法的建立  29-37
    1 材料  29-30
      1.1 试验动物与试剂  29
      1.2 主要试剂配制  29-30
    2 方法  30-31
      2.1 小鼠免疫  30
      2.2 间接ELISA 法的建立及抗血清效价的检测  30
      2.3 抗血清特异性的检测  30-31
    3 结果  31-34
      3.1 不同检测抗原包被量和酶浓度确定  31
      3.2 不同封闭液的选择  31-32
      3.3 包被条件选择  32
      3.4 抗血清效价检测  32-33
      3.5 抗原特异性检测  33-34
    4 讨论  34-37
      4.1 间接竞争ELISA 检测方法的建立  34-35
      4.2 小鼠免疫  35-37
  第三章 单克隆抗体的制备与鉴定  37-58
    1 材料  37-39
      1.1 细胞株  37
      1.2 试验动物  37
      1.3 试剂  37
      1.4 主要试剂配制  37-39
    2 方法  39-45
      2.1 细胞融合  39-41
      2.2 杂交瘤细胞上清的检测  41
      2.3 杂交瘤细胞株的建立  41-42
      2.4 阳性杂交瘤细胞的扩大培养与细胞上清效价的检测  42
      2.5 单克隆抗体亚类的鉴定  42
      2.6 阳性杂交瘤细胞的冻存与复苏  42-43
      2.7 腹水型单克隆抗体的大量制备及浓度的测定  43-44
      2.8 腹水型单克隆抗体的纯化  44
      2.9 腹水纯化前与纯化后的效价检测  44
      2.10 腹水型单克隆抗体纯化后的SDS—PAGE 电泳  44-45
    3 结果  45-53
      3.1 细胞融合时各细胞比例数  45-46
      3.2 细胞融合率  46
      3.3 筛选方法的建立结果  46
      3.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选  46-48
      3.5 阳性杂交瘤细胞株的建立  48-50
      3.6 阳性杂交瘤细胞上清效价  50
      3.7 抗体亚类鉴定  50
      3.8 单克隆腹水效价及腹水浓度检测结果  50-52
      3.9 单克隆腹水纯化与分析  52-53
      3.10 单克隆抗体的SDS—PAGE 电泳  53
    4 讨论  53-58
      4.1 细胞融合的影响因素  53-55
      4.2 杂交瘤细胞克隆与扩大培养  55-58
结论  58-59
参考文献  59-66
致谢  66-67
个人简介  67-68
导师简介  68-69

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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