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抗卵清蛋白单克隆抗体的制备及卵清蛋白、醇溶蛋白ELISA检测方法的建立

作　者: 秦倩茹
导　师: 马洪明
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产品加工及贮藏工程
关键词: 单克隆抗体卵清蛋白醇溶蛋白 ELISA检测方法
分类号: R155.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

过敏性疾病影响着全世界近1/4的人口,其中3%-5%为食物过敏,被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一。2005年7月19日,美国国会通过一项“食品过敏源标签和消费者保护法(FALCPA)”法案,要求食品生产商清楚地标明该食品是否含有8种最常见的食品过敏原。而在检验检疫系统对进出口的食品进行常见的8大类过敏原(蛋、奶、大豆、花生、小麦、树果、鱼和贝类)检测,缺乏相应的标准和方法。本文致力于研究鸡蛋和小麦过敏原的检测方法,并为制定相应的标准提供理论依据。卵清蛋白是鸡蛋的主要蛋白质,也是鸡蛋的主要过敏原之一。本文制备了抗卵清蛋白单克隆抗体,建立了常见过敏原鸡蛋卵清蛋白的ELISA检测方法。以PBS溶解高纯度卵清蛋白,免疫8周龄的BALB/c小鼠3次,直至效价达到10-5之后,再加强免疫1次,三天后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞经PEG融合,经间接ELISA和有限稀释法筛选,获得了6株分泌抗卵清蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别是OVA-1C6、OVA-2F9、OVA-2D8、OVA-2D2、OVA-3H6、OVA-3G9,培养上清效价分别为1:30000、1:30000、1:10000、1:10000、1:5000、1:50000,细胞冻存复苏后效价不变；OVA-1C6的亚型是IgG2b,OVA-2D8和OVA-2D2是IgG2a,OVA-2F9、OVA-3H6和OVA-3G9的亚型是IgG1；与BSA、猪血清、兔血清均没有交叉反应。选取其中抗体效价最高的两株杂交瘤细胞OVA-2F9和OVA-3G9,制备腹水以及纯化,纯化后的抗体分别与HRP偶联。将偶联成功的HRP-2F9抗体作为酶标抗体,OVA-3G9作为包被抗体,经方阵滴定法确定最适的包被抗体浓度是1：200和酶标抗体工作浓度是1:1000,在最适浓度下优化双抗体夹心ELISA测卵清蛋白的条件。利用优化后的试验条件进行ELISA双抗体夹心法检测,建立卵清蛋白的标准曲线。检测的最佳线性范围是97.66ng/ml-6250ng/ml,r≥0.995,最低检测限度为97.66ng/ml,大约0.1ppm。在同一次实验内,样品的回收率在91.92%-100.34%之间,精密度CV为1.22%-5.14%,3次试验间精密度CV为3.17%-6.83%。可在4℃放置一个月。与鸡肉、猪肉、牛肉无交叉反应,对鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋中的卵清蛋白具有特异性。自制的ELISA试剂盒与RIDASCREEN成品试剂盒检测实际样品进行比较结果基本相符,并且检出灵敏度为成品试剂盒(1ppm)的10倍。醇溶蛋白是小麦等谷物类的主要过敏原,约占小麦种子贮藏蛋白总量的40%,因此可以作为小麦的检测指标,本文建立常见过敏原小麦醇溶蛋白的ELISA检测方法。以65%乙醇溶解sigma公司的小麦醇溶蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫血清作为阳性对照。以鼠抗醇溶蛋白单抗为包被抗体,HRP标记兔抗醇溶蛋白多抗为酶标抗体,以方阵滴定法确定包被抗体的包被浓度是2μg/ml和酶标抗体的最适工作浓度是1:8000,在最适浓度下选择合适的封闭液,即含10%胎牛血清的PBST,建立双抗体夹心ELISA法检测醇溶蛋白,拟合标准曲线并制备醇溶蛋白试剂盒。检测的最佳线性范围是19.53-5000ng/ml, R2>0.99,最低检测限为19.53ng/ml,对应的食品样品检测限为7.81ppm。样品的回收率在93.57%～105.72%之间,试验内CV为3.07%-5.91%,试验间CV为0.26%-5.24%,对大麦有一定的交叉反应性,可在4℃放置两周,稳定性较好。本文分别建立了卵清蛋白定量和醇溶蛋白ELISA定量检测方法。准确度、精密度和稳定性均较高。其中卵清蛋白ELISA检测试剂盒定量检出灵敏度是进口产品的10倍,检测费用大约只有进口产品的一半,试剂盒的技术参数优于或达到国外同类产品的水平,能满足日常进出口检测的要求,并为国内制定相应的方法和标准奠定了理论基础。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-16
第一章文献综述  16-26
  1.1 食品过敏症及其发病机制  16-18
    1.1.1 食品过敏症及危害  16-17
    1.1.2 食品过敏的发病机制  17-18
    1.1.3 食品过敏原的研究现状与进展  18
  1.2 食品过敏原的检测方法  18-23
    1.2.1 体内检测  18-19
      1.2.1.1 双盲对照食品激发实验  19
      1.2.1.2 皮肤试验  19
    1.2.2 体外检测  19-22
      1.2.2.1 酶联免疫吸附实验  19-20
      1.2.2.2 放射过敏原吸附试验  20
      1.2.2.3 组胺释放实验  20-21
      1.2.2.4 食品过敏原指纹图谱快速检测法  21
      1.2.2.5 蛋白质检测芯片法  21
      1.2.2.6 PCR方法  21-22
      1.2.2.7 生物共振技术检测法  22
    1.2.3 国内外研究概况及国内存在的问题  22-23
  1.3 研究目的及意义  23-26
第二章卵清蛋白单克隆抗体的制备  26-47
  2.1 试验材料  26-29
    2.1.1 试验动物和细胞  26
    2.1.2 主要实验试剂  26-27
    2.1.3 主要实验仪器和耗材  27
    2.1.4 主要试剂配制  27-29
      2.1.4.1 常规试剂配制  27-28
      2.1.4.2 细胞融合试剂配制  28
      2.1.4.3 ELISA试剂配制  28-29
      2.1.4.4 SDS-PAGE试剂配制  29
  2.2 试验方法  29-36
    2.2.1 动物免疫  29-30
    2.2.2 小鼠血清效价的测定  30-31
    2.2.3 杂交瘤细胞株的建立  31-35
      2.2.3.1 饲养细胞的制备  31
      2.2.3.2 SP2/0骨髓瘤细胞悬液的制备  31
      2.2.3.3 免疫脾细胞悬液的制备  31-32
      2.2.3.4 细胞融合  32
      2.2.3.5 杂交瘤细胞的筛选  32
      2.2.3.6 杂交瘤细胞的克隆  32-33
      2.2.3.7 腹水法大量制备单克隆抗体  33-34
      2.2.3.8 杂交瘤细胞的冻存  34
      2.2.3.9 单克隆抗体的纯化  34-35
    2.2.4 单克隆抗体的鉴定  35-36
      2.2.4.1 单抗效价测定和腹水中的蛋白质含量测定  35
      2.2.4.2 单抗类型和亚类的测定  35-36
      2.2.4.3 腹水抗体的纯度分析  36
      2.2.4.4 单抗的特异性鉴定  36
      2.2.4.5 单抗的稳定性分析  36
  2.3 结果与分析  36-43
    2.3.1 免疫小鼠血清效价的测定  36-37
    2.3.2 细胞融合和筛选结果  37-38
    2.3.3 克隆化结果  38-39
    2.3.4 单克隆抗体效价  39-40
    2.3.5 单克隆抗体亚类的鉴定  40-41
    2.3.6 腹水中蛋白质含量及抗体效价  41-42
    2.3.7 腹水抗体纯度分析  42-43
    2.3.8 单抗特异性的鉴定  43
    2.3.9 单抗稳定性分析  43
  2.4 讨论与小结  43-47
    2.4.1 关于动物免疫  44
    2.4.2 关于细胞融合  44-45
    2.4.3 关于克隆和筛选  45
    2.4.4 单克隆抗体的纯化  45
    2.4.5 小结  45-47
第三章卵清蛋白ELISA检测方法的建立  47-67
  3.1 实验材料  47-50
    3.1.1 主要实验试剂  47-48
    3.1.2 主要实验器材  48
    3.1.3 实验试剂的配制  48-50
      3.1.3.1 标记抗体试剂配制  48
      3.1.3.2 ELISA试剂配制  48-50
  3.2 实验方法  50-54
    3.2.1 HRP标记抗体的制备  50-51
      3.2.1.1 简易过碘酸钠法  50
      3.2.1.2 HRP标记抗体的工作浓度  50-51
    3.2.2 常规双抗体夹心ELISA法的基本程序  51-52
    3.2.3 包被抗体和酶标抗体的最适浓度的确定  52
    3.2.4 双抗体夹心ELISA条件的优化  52-53
      3.2.4.1 抗体包被条件的选择  52
      3.2.4.2 封闭条件的优化  52-53
      3.2.4.3 酶标抗体与待测抗原反应时间的优化  53
      3.2.4.4 抗原与包被抗体反应条件的优化  53
      3.2.4.5 底物作用时间的优化  53
    3.2.5 卵清蛋白标准曲线的建立和最低检测限的确定  53
    3.2.6 精密度、准确度和重复性验证  53
    3.2.7 特异性验证  53-54
    3.2.8 稳定性验证  54
    3.2.9 试剂盒比较  54
  3.3 结果与分析  54-63
    3.3.1 HRP标记抗体检测  54-55
      3.3.1.1 IgG量的测定  54-55
      3.3.1.2 HRP标记抗体的工作浓度  55
    3.3.2 包被抗体和酶标抗体的最适浓度  55-56
    3.3.3 双抗体夹心ELISA条件的确定  56-59
      3.3.3.1 抗体包被条件的确定  56-57
      3.3.3.2 封闭条件的确定  57-58
      3.3.3.3 酶标抗体与待测抗原的最佳反应时间  58
      3.3.3.4 抗原与包被抗体的最佳反应条件  58-59
      3.3.3.5 底物的最佳反应时间  59
    3.3.4 优化的双抗体夹心ELISA基本程序  59-60
    3.3.5 卵清蛋白定量的标准曲线和最低检测限  60
    3.3.6 精密度、准确度和重复性验证  60-61
    3.3.7 抗体夹心ELISA法的特异性  61
    3.3.8 稳定性验证  61
    3.3.9 与成品试剂盒比较结果  61-63
  3.4 讨论与小结  63-67
    3.4.1 关于免疫球蛋白标记技术  63-64
    3.4.2 关于ELISA检测  64
    3.4.3 关于ELISA封闭液的选择  64
    3.4.4 ELISA反应条件的优化  64-65
    3.4.5 标准曲线的拟合  65
    3.4.6 小结  65-67
第四章麦醇溶蛋白ELISA检测方法的建立  67-80
  4.1 实验材料  67-70
    4.1.1 主要实验动物  67
    4.1.2 主要实验试剂  67-68
    4.1.3 主要实验器材  68
    4.1.4 主要实验试剂配制  68-70
      4.1.4.1 ELISA试剂配制  68-69
      4.1.4.2 各种封闭液配制  69
      4.1.4.3 样品前处理  69-70
  4.2 实验方法  70-72
    4.2.1 免疫动物  70
    4.2.2 酶标抗体浓度的初步确定  70
    4.2.3 包被抗体浓度的初步确定  70
    4.2.4 包被抗体和酶标抗体的最适浓度的确定  70
    4.2.5 封闭液的选择  70-71
    4.2.6 双抗体夹心ELISA法的基本程序  71
    4.2.7 方法验证  71-72
      4.2.7.1 醇溶蛋白定量标准曲线的建立  71
      4.2.7.2 最低检测限的确定  71
      4.2.7.3 精密度、准确度和重复性验证  71-72
      4.2.7.4 特异性验证  72
      4.2.7.5 稳定性验证  72
      4.2.7.6 实际样品检测  72
  4.3 结果与分析  72-77
    4.3.1 免疫小鼠血清效价  72
    4.3.2 酶标抗体浓度的初步确定  72
    4.3.3 包被抗体浓度的初步确定  72-73
    4.3.4 包被抗体和酶标抗体的最适浓度  73-74
    4.3.5 封闭液选择  74
    4.3.6 醇溶蛋白标准曲线的建立  74-75
    4.3.7 精密度、准确度和重复性验证  75
    4.3.8 特异性验证  75-76
    4.3.9 稳定性验证  76
    4.3.10 试剂盒应用  76-77
  4.4 讨论与小结  77-80
    4.4.1 关于ELISA封闭液的选择  77
    4.4.2 标准曲线的拟合  77-78
    4.4.3 ELISA试验的影响因素  78-79
    4.4.4 小结  79-80
结论  80-81
参考文献  81-85
缩略词  85-86
致谢  86-87
个人简历  87
发表的学术论文  87

抗卵清蛋白单克隆抗体的制备及卵清蛋白、醇溶蛋白ELISA检测方法的建立

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