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猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位鉴定及受体结合域的初步筛选

作　者: 孙东波
导　师: 陈洪岩
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪流行性腹泻病毒 S蛋白 抗原表位 受体结合域 噬菌体展示
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起猪的一种急性、高度接触性肠道传染病。在过去30年间,虽然PEDV常规疫苗被广泛应用,但是PED在各国猪场中的感染仍然非常严重,给养猪业带来巨大经济损失。所以,关于PEDV的新型疫苗、侵入机制和免疫机理的研究是十分必要的。众所周知,病毒的抗原表位、受体与受体结合域在病毒侵染和抗病毒免疫中起着重要作用。S蛋白是PEDV一个表面的结构蛋白,它既含有介导病毒侵入宿主细胞的受体结合域,又拥有介导机体产生病毒中和抗体的抗原表位。鉴于此,本研究对PEDV S蛋白的抗原表位和受体结合域进行筛选与鉴定,为PEDV诊断方法和新型疫苗的研究以及抗病毒免疫策略的设计提供信息。为获得PEDV S基因及其分子特性,本试验克隆了PEDV CV777毒株细胞适应毒的S基因,序列比对结果表明,获得的S基因与PEDV CV777毒株S基因参考序列核苷酸的同原性为99.4 %,推导氨基酸的同原性为99.8 %。S蛋白氨基酸的疏水性、信号肽序列和N-侧链连接糖基化位点分析表明,克隆的S基因保持了其亲本毒株CV777 S基因的分子特性。根据冠状病毒II群成员S蛋白S1和S2亚基之间的保守基序(GxCx和保守九肽),PEDV S蛋白可以被划分为2个功能区即S1(第1～789位氨基酸)和S2(第790～1383位氨基酸),其中S1区包含了病毒主要的中和表位和受体结合域。为了分析S蛋白S1区抗原表位特征,利用fd丝状噬菌体展示系统,构建了S1基因特异性肽库,以PEDV多克隆血清为靶蛋白对构建的肽库进行3轮生物淘选,结果获得了3个高亲和力序列,分别命名为S1P1(第248～280位氨基酸)、S1P2(第442～499位氨基酸)和S1P3(第697～742位氨基酸)。ELISA和Western blot结果显示,S1P1、S1P2和S1P3的GST融合蛋白均与PEDV多克隆血清反应,其中S1P3反应性最强。为了进一步揭示S1P1、S1P2和S1P3短肽的抗原性,三个短肽GST融合蛋白和它们串联后GST融合蛋白(S1P123-GST)的单因子鼠血清被制备。间接免疫荧光试验(IFA)和ELISA结果证实,抗S1P2、S1P3和S1P123 GST融合蛋白的单因子鼠血清能识别天然的PEDV。本试验结果表明,S1P1、S1P2和S1P3是PEDV S蛋白3个线性抗原表位,S1P2和S1P3表位具有良好的免疫原性。PEDV S蛋白S1区在介导中和抗体产生过程中发挥重要作用。为了鉴定S蛋白S1区的免疫优势区,利用PCR扩增了4个相互重叠、覆盖S1基因的片段,分别命名为S1A、S1B、S1C和S1D。四个片段PCR产物分别克隆到pGEX-6p-1原核表达载体后,经IPTG诱导均获得了表达。Western blot和ELISA结果显示,S1D-GST融合蛋白(第636～789位氨基酸)与PEDV的多克隆抗体具有强反应性。IFA和Western blot结果表明,抗S1D-GST融合蛋白的鼠血清能够识别天然的S蛋白。病毒中和试验表明,S1D-GST融合蛋白能介导鼠产生对PEDV具有中和作用的抗体。为了对中和表位区(S1D)的抗原表位进行精确定位,制备并获得了6株抗S1D特异性的单克隆抗体,Western blot结果显示,6株单克隆抗体均能识别天然的S蛋白。利用噬菌体展示和肽扫描技术对6株单克隆抗体识别的表位进行了鉴定,结果显示,单克隆抗体2C4、3C3和5F8识别的表位是S蛋白的第744～759位氨基酸(S1D5),单克隆抗体3G3、6E6和3G5识别的表位是S蛋白的第756～771位氨基酸(S1D6)。ELISA和IFA结果表明,抗S1D5和S1D6表位融合蛋白的鼠血清均能识别天然的S蛋白。进一步的肽扫描(Pepscan)结果显示,S1D5表位的核心序列是Y748SNIGVCK755(SS5),S1D6表位的核心序列是L764QDGQVKI771(SS6)。病毒细胞受体和受体结合域的信息能为病毒疫苗和抗病毒药物设计提供策略。为了揭示PEDV的受体结合域信息,本试验以PEDV可溶性的细胞受体猪氨基肽酶N(pAPN)为靶蛋白对S1基因特异性肽库进行3轮生物淘选,然后对30个淘选的噬菌体克隆进行测序。序列分析发现,2个噬菌体克隆展示无义氨基酸序列,其余28个噬菌体克隆展示的氨基酸序列位于S蛋白第249～529位氨基酸区域,这个区域被命名为MRR。为了进一步印证MRR区与pAPN在体外的相互作用,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对MRR基因进行真核表达。Western blot结果表明,表达的MRR重组蛋白能够与兔抗PEDV的多克隆抗体反应。但是,进一步的pull-down实验结果显示,利用抗pAPN的鼠血清通过Western blot检测不到与MRR重组蛋白结合的pAPN。本试验结果提示,PEDV S蛋白第249～529位氨基酸区域(MRR)是pAPN细胞受体的一个潜在的结合区域。本研究鉴定出PEDV S蛋白5个线性抗原表位即S1P1(第248～280位氨基酸)、S1P2(第442～499位氨基酸)、S1P3(第697～742位氨基酸)、SS5(第748～755位氨基酸)和SS6(第764～771位氨基酸),1个中和表位区(S1D,第636～789位氨基酸),1个猪氨基肽酶N潜在的受体结合域(MRR,第249～529位氨基酸)。这些抗原表位以及受体结合域的揭示对进一步分析PEDV S蛋白的结构与功能以及建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法和基于表位的疫苗设计具有指导意义。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-18
第一章 绪论  18-42
  1.1 PED概述  18-22
    1.1.1 流行病学  18-19
    1.1.2 临床症状  19
    1.1.3 发病机理  19-20
    1.1.4 病理变化  20
    1.1.5 诊断  20-21
    1.1.6 组织嗜性和免疫  21
    1.1.7 防治  21-22
  1.2 PEDV的生物学特性  22-27
    1.2.1 PEDV的形态结构  22-23
    1.2.2 PEDV理化特性  23
    1.2.3 PEDV抗原性  23
    1.2.4 PEDV细胞培养特性  23
    1.2.5 PEDV病毒学学分类地位  23-24
    1.2.6 PEDV的基因组结构和复制  24-26
    1.2.7 PEDV基因组编码蛋白及其功能  26-27
  1.3 PEDV及其它冠状病毒B细胞抗原表位和细胞受体的研究进展  27-32
    1.3.1 PEDV及其它冠状病毒S蛋白B细胞抗原表位的研究进展  28-29
    1.3.2 PEDV及其它冠状病毒受体蛋白的研究进展  29-31
    1.3.3 PEDV及其它冠状病毒受体结合域的研究进展  31-32
  1.4 抗原表位研究方法  32-38
    1.4.1 B细胞抗原表位研究方法  32-37
    1.4.2 T细胞表位研究方法  37
    1.4.3 抗原表位研究的应用及意义  37-38
  1.5 病毒受体结合域研究的方法  38-41
    1.5.1 常规方法  38-40
    1.5.2 生物物理学方法  40-41
  1.6 本研究的目的与意义  41-42
第二章 PEDV S基因的克隆及其分子特性分析  42-52
  2.1 材料与方法  43-46
    2.1.1 病毒和细胞  43
    2.1.2 质粒与菌种  43
    2.1.3 生化试剂  43
    2.1.4 主要仪器  43-44
    2.1.5 PEDV的细胞培养  44
    2.1.6 PEDV病毒RNA的提取  44
    2.1.7 cDNA合成的引物  44-45
    2.1.8 Sa、Sb和Sc片段的克隆  45
    2.1.9 S基因及其编码蛋白的分子特性分析  45-46
  2.2 结果  46-50
    2.2.1 PEDV的细胞培养  46
    2.2.2 Sa、Sb和Sc片段的RT-PCR扩增  46-47
    2.2.3 PEDV S基因序列分析及分子特性  47-49
    2.2.4 S蛋白S1 和S2 功能区的划分  49-50
  2.3 讨论  50-52
第三章 PEDV S蛋白S1 区B细胞抗原表位的筛选和鉴定  52-65
  3.1 材料与方法  53-58
    3.1.1 质粒和菌种  53
    3.1.2 试剂盒与主要生化试剂  53
    3.1.3 实验动物与血清  53
    3.1.4 仪器设备  53
    3.1.5 PEDV S1 基因特异性肽库的构建  53-56
    3.1.6 S1 基因特异性肽库的生物淘选及展示表位的鉴定  56
    3.1.7 S1P1、S1P2 和S1P3 抗原短肽ELISA与Western blot分析  56-57
    3.1.8 S1P1、S1P2 和S1P3 抗原短肽的免疫原性分析  57-58
  3.2 结果  58-64
    3.2.1 PEDV S1 基因PCR扩增  58-59
    3.2.2 PEDV S1 基因DNaseI消化  59
    3.2.3 S1 基因特异性肽库鉴定  59-60
    3.2.4 S1 基因特异性肽库生物淘选  60-61
    3.2.5 抗原短肽ELISA和Western blot分析  61-62
    3.2.6 抗原短肽的免疫原性分析  62-64
  3.3 讨论  64-65
第四章 PEDV S蛋白S1 区原核表达及其免疫优势区鉴定  65-75
  4.1 材料与方法  66-69
    4.1.1 质粒、细胞和菌种  66
    4.1.2 试剂盒与生化试剂  66
    4.1.3 实验动物和血清  66
    4.1.4 仪器设备  66
    4.1.5 S1A、S1B、S1C和S1D片段的原核表达与纯化  66-68
    4.1.6 S1A、S1B、S1C和S1D重组蛋白的免疫活性分析  68
    4.1.7 S1A、S1B、S1C和S1D重组蛋白单因子血清制备及其免疫活性分析  68
    4.1.8 S1A、S1B、S1C和S1D重组蛋白单因子血清的病毒中和试验  68-69
    4.1.9 PEDV S蛋白S1D区的序列比对分析  69
  4.2 结果  69-74
    4.2.1 S1A、S1B、S1C和S1D片段PCR扩增  69-70
    4.2.2 S1A、S1B、S1C和S1D片段的表达与纯化  70
    4.2.3 S1A、S1B、S1C和S1D重组蛋白的免疫活性分析  70-71
    4.2.4 S1A、S1B、S1C和S1D重组蛋白单因子血清的免疫活性分析  71-73
    4.2.5 S1D重组蛋白单因子血清中和活性  73
    4.2.6 PEDV S蛋白S1D区序列比对分析  73-74
  4.3 讨论  74-75
第五章 PEDV S蛋白S1D区单克隆抗体的制备及表位鉴定  75-89
  5.1 材料与方法  76-81
    5.1.1 质粒、菌种和病毒  76
    5.1.2 试剂盒与主要生化试剂  76
    5.1.3 实验动物  76
    5.1.4 仪器设备  76
    5.1.5 单克隆抗体制备  76-77
    5.1.6 McAbs免疫活性与中和活性鉴定  77-78
    5.1.7 S1D单克隆抗体对PEDV S1 基因特异性肽库的生物淘选及噬菌体ELISA  78
    5.1.8 S1D淘选表位区（MER）的原核表达与表位鉴定  78-80
    5.1.9 S1D5 和S1D6 抗原表位免疫原性鉴定  80
    5.1.10 S1D5 和S1D6 表位的核心氨基酸鉴定  80-81
  5.2 结果  81-87
    5.2.1 S1D重组蛋白纯化  81
    5.2.2 S1D单克隆抗体亚型鉴定和腹水效价测定  81-82
    5.2.3 S1D单克隆抗体免疫活性和中和活性的鉴定  82-83
    5.2.4 S1 基因特异性肽库的生物淘选及噬菌体ELISA  83
    5.2.5 S1D淘选表位区MER抗原表位的精确定位  83-85
    5.2.6 S1D5 和S1D6 抗原表位免疫原性鉴定  85-87
    5.2.7 S1D5 和S1D6 表位的核心氨基酸鉴定  87
  5.3 讨论  87-89
第六章 PEDV S蛋白受体结合域的筛选与鉴定  89-101
  6.1 材料与方法  90-93
    6.1.1 质粒、细胞、菌种和肽库  90
    6.1.2 试剂盒与主要生化试剂  90
    6.1.3 实验动物  90
    6.1.4 仪器设备  90-91
    6.1.5 pAPN对PEDV S1 基因特异性肽库的淘选  91
    6.1.6 pAPN多克隆血清制备  91
    6.1.7 MRR重组蛋白的真核表达  91-92
    6.1.8 MRR重组蛋白的免疫活性分析  92
    6.1.9 MRR重组蛋白与pAPN相互作用检测  92-93
  6.2 结果  93-99
    6.2.1 PEDV S1 基因特异性肽库的pAPN淘选  93-95
    6.2.2 MRR基因重组pFastBacHTB真核表达载体的构建  95-96
    6.2.3 MRR基因重组杆状病毒制备及鉴定  96-97
    6.2.4 MRR重组蛋白的表达与免疫活性鉴定  97
    6.2.6 MRR重组蛋白与pAPN的相互作用  97-99
  6.3 讨论  99-101
第七章 全文结论  101-102
参考文献  102-117
致谢  117-118
作者简历  118-119

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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