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环境中苯基缩水甘油醚和多溴联苯醚的基因和细胞毒性初步研究

作　者: 宋任芳
导　师: 傅家谟；盛国英；张文兵；George D.D.Jones；Peter Farmer
学　校: 中国科学院研究生院（广州地球化学研究所）
专　业: 环境科学
关键词: HPLC-MS/MS 寡核苷酸 DNA加合物 PBDE 基因表达细胞周期 RT-PCR 基因芯片
分类号: X503.1
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

本研究报道了两种广泛存在的环境有机污染物所引起的基因和细胞毒性。苯基缩水甘油醚(PGE)是一种常见的工业原料；多溴联苯醚((PBDEs)是一种阻燃剂，它们在环境中广泛存在而且具有生物累积效应，人类持续暴露在含有这些污染物的环境中对健康造成的影响还没有足够的研究。首先，利用高效液相串联质谱(HPLC-MS／MS)表征了不同序列和不同碱基含量的寡核甘酸。在三种流动相(TEAA，TEAB，和HFIP)中利用HPLC-MS／MS表征了G富集，T富集，和A+T富集的寡核甘酸片段以及单核甘酸多态性(SNPs)片段。在TEAA和TEAB的流动相中，片段中G和T的含量显著影响它们的保留时间，而在HFIP的流动相中，保留时间与片段的长度有关。在TEAA和TEAB的流动相中，离子流的强度比其在HFIP的流动相中的响应值要低很多。具有自互补序列的A+T富集的寡核甘酸片段在TEAA和TEAB的流动相中的保留时间要明显少于没有自互补序列片段的保留时间，而在HFIP的流动相中二者没有明显的差别。在HFIP的流动相中没有自互补序列的片段的电荷分布状态要明显高于具有自互补序列的片段。另外，在本研究选取的寡核甘酸多态性的保留时间顺序为C＜G＜A＜T，多态性表现在3’端的时候更容易从质谱的离子碎片中加以区分。在以上研究的基础上，本研究进一步利用HPLC-MS／MS分别表征了苯基缩水甘油醚和寡核甘酸加合物。具有加合物的片段保留时间要比没有加合物的片段的长，利用于离子碎片信息确定了加合物的结构和其在不同片段中的位点，明确了加合物的形成与片段的序列有很大的关系。其次，利用两种细胞系对羟基多溴联苯醚诱导的细胞毒性进行了研究。H4IIE是公认的检测环境含氯污染物及其相似物毒性的有效细胞。H295R细胞包含了与肾上腺素合成相关的细胞通路，非常适合研究环境有机污染物的毒性反应。单细胞电泳可以检测基因断裂和修复过程。在本研究中，羟基多溴联苯醚没有明显的基因损伤。为了进一步研究此类化合物对其它细胞毒性的影响，我们研究了羟基多溴联苯醚对细胞存活率，细胞分裂和细胞生长周期分布的影响。结果表明，羟基多溴联苯醚可以导致细胞死亡，抑制细胞分裂，对细胞周期合成有抑制作用。2’OH-BDE85比2’OH-BDE47具有更高的毒性。根据以上研究，最后本研究利用实时定量PCR检测了25种多溴联苯醚以及衍生物对肾上腺素基因表达的影响。某些化合物可以对的的基因表达有显著影响。利用基因芯片检测了2种羟基多溴联苯醚对整个基因组的基因表达影响。在本研究中，与2’OH-BDE47相比，2’OH-BDE85能引起更多的基因表达变化异常。这与细胞毒性实验结果一致。实时定量PCR验证了基因芯片数据，证明基因芯片关于基因表达变化的数据可信。因为没有发现明显的基因毒性，本研究指出多溴联苯醚的生物影响是通过后生效应而不是通过基因毒性的路径来发生作用的。如何规避风险需进一步研究化合物的暴露风险。在学科交叉的基础上，本论文对环境污染物与健康的关系进行的探索，为更好的了解环境有机毒害物质的基凶毒理和细胞毒性影响机制具有重要意义。

全文目录

中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章总论  12-22
  第一节所选用的环境有机污染物的毒理研究背景  13-16
  第二节高效液相串联质谱在有机污染物与DNA加合物和寡核苷酸方面的研究背景  16-18
  第三节生物学方法在有机污染物基因和细胞毒性方面的研究背景  18-20
  第四节本研究的目的  20-22
第二章高效液相串联质谱表征不同特点的寡核苷酸  22-54
  第一节研究背景和目的  22-23
    2.1.1 研究背景  22-23
    2.1.2 研究目的  23
  第二节材料方法  23-26
    2.2.1 化学材料  23-25
    2.2.2 流动相制备  25
    2.2.3 仪器  25-26
  第三节结果和讨论  26-51
    2.3.1 G-富集和T-富集寡核苷酸在不同流动相中的液相保留时间(第一部分)  26-27
    2.3.2 G-富集和T-富集寡核苷酸在不同流动相中的质谱特征  27-33
    2.3.3 A+T-富集的寡核苷酸在不同流动相中液相色谱的保留时间分布(第二部分)  33-35
    2.3.4 A+T寡核苷酸在质谱上的表征  35-44
    2.3.5 P53基因中的SNPs在液相保留时间的分布(第三部分)  44
    2.3.6 P53基因中SNPs在质谱上的表征  44-51
  第四节小结  51-54
第三章高效液相串联质谱对苯基缩水甘油醚DNA加合物的表征  54-66
  第一节研究背景和目的  54-55
    3.1.1 高效液相串联质谱表征加合物的简介  54
    3.1.2 研究目的  54-55
  第二节材料方法  55
    3.2.1 材料  55
    3.2.2 方法  55
  第三节结果和讨论  55-63
    3.3.1 高效液相串联质谱表征加合物  55-63
  第四节小结  63-66
第四章两种细胞系中羟基多溴联苯醚诱导的基因和细胞毒性研究  66-92
  第一节研究背景和目的  66-70
    4.1.1 多溴联苯醚的毒性和单细胞电泳以及相关细胞毒性分析的方法介绍  66-69
    4.1.2 研究目标  69-70
  第二节材料方法  70-74
    4.2.1 化学材料  70
    4.2.2 细胞培养与染毒  70-71
    4.2.3 单细胞电泳分析条件  71
    4.2.4 MTT试验条件  71-73
    4.2.5 细胞分裂试验方法  73
    4.2.6 细胞生长周期分布分析  73
    4.2.7 数据分析  73-74
  第三节结果和讨论  74-90
    4.3.1 单细胞电泳评价基因损伤  74-76
    4.3.2 羟基多溴联苯醚诱导的细胞存活率  76-78
    4.3.3 羟基多溴联苯醚诱导的细胞分裂研究  78-80
    4.3.4 羟基多溴联苯醚诱导的1到72小时的细胞周期分布变化  80-83
    4.3.5 羟基多溴联苯醚诱导的2μM到20μM小时的细胞周期分布变化  83-90
  第四节小结  90-92
第五章定量PCR检测多溴联苯醚诱导的肾上腺素基因通道相关基因表达的变化  92-110
  第一节简介和目标  92-97
    5.1.1 Q-RT-PCR的原理  92-97
    5.1.2 研究目标  97
  第二节材料和方法  97-100
    5.2.1 材料  97-98
    5.2.2 方法  98-100
  第三节结果与讨论  100-109
    5.3.1 化合物对CYP基因家族表达的影响  100-105
    5.3.2 对羟基类固醇脱氢酶类基因表达的影响  105-106
    5.3.3 对StAR和HMGR表达的影响  106-109
  第四节本章小结  109-110
第六章寡核苷酸基因芯片方法检测两种羟基多溴联苯醚对基因表达影响  110-165
  第一节简介和目标  110-113
    6.1.1 简介  110-112
    6.1.2 研究目标  112-113
  第二节材料和方法  113-120
    6.2.1 材料  113
    6.2.2 方法  113-118
    6.2.3 样品质量的控制  118-120
    6.2.4 统计分析  120
  第三节结果和讨论  120-164
    6.3.1 Q-RT-PCR用于基因芯片的确确证、浓度效应和靶基因特性分析  155-164
  第四节小结  164-165
第七章最后结论与将来的研究方向  165-167
  第一节最后结论  165-166
  第二节将来的研究方向  166-167
参考文献:  167-197
PUBLICATIONS AND SUBMISSION  197-199
致谢  199-200
在读期间参加的课题  200-201

环境中苯基缩水甘油醚和多溴联苯醚的基因和细胞毒性初步研究

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