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低水平铅暴露对发育期大鼠视网膜、视神经的影响

作　者: 邵玉红
导　师: 瞿佳
学　校: 浙江大学
专　业: 眼科学
关键词: SD大鼠发育期铅暴露视网膜动物模型脱髓鞘视神经凋亡 NMDA受体亚单位基因表达
分类号: R774
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

第一部分发育期低水平铅暴露动物模型的建立目的建立发育期SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠低水平铅暴露的动物模型。观察出生后不同发育时期正常及低水平铅暴露大鼠血铅、视网膜铅水平，为进一步研究铅暴露对婴幼儿视觉系统的损害提供依据。方法健康清洁级SD雌鼠怀孕后随机分为两组，从受孕3-5天开始分别饮用去离子水和0.2％醋酸铅溶液，且各自持续整个妊娠期和哺乳期。所产子代分为2组用于实验：(1)、正常对照组：饮用去离子水母鼠的子代继续饮用去离子水；(2)、铅暴露组：铅暴露母鼠的子代断乳后停止饮用0.2％醋酸铅溶液，改饮用去离子水。在仔鼠不同发育时期P3、P6、P9、P12、P15、P20、P25、P30、P40、P50天取仔鼠视网膜和P6的血样。采用无火焰石墨炉原子吸收光谱法测定视网膜铅和血铅含量。结果1、出生后第六天铅暴露仔鼠血铅浓度明显高于正常对照组。2、铅暴露仔鼠在出生的P3、P6、P9、P12、P15、P20、P25、P30、P40、P50天的视网膜铅浓度随着发育逐渐升高，铅暴露组视网膜铅水平均高于正常对照组，P20视网膜铅含量最高，之后下降。结论1、铅暴露仔鼠视网膜铅水平随着发育逐渐升高，铅暴露组视网膜铅水平均高于正常对照组，约在P20天达到峰值。铅在机体内无任何生理作用，视网膜铅水平升高是视网膜以及视觉神经系统损害的基础。2、发育期铅暴露仔鼠视网膜铅与血铅代谢规律的相关性更接近。但视网膜铅的半衰期可能更长，代谢更慢。第二部分低水平铅暴露对发育期大鼠视网膜、视神经形态学影响目的通过不同发育阶段SD大鼠眼球石蜡切片HE(Haematoxylin Eosin，HE)染色，视神经HE及罗克沙尔固兰(Luxol Fast Blue)染色，光镜观察正常及铅暴露仔鼠视网膜各层发育变化规律，视神经面积及髓鞘发育变化模式。超薄切片电镜观察铅暴露仔鼠视网膜、视神经超微结构的变化。探讨铅对发育期大鼠视网膜、视神经的形态学的影响。方法正常及铅暴露仔鼠于出生的P3、P6、P9、P12、P15、P20、P25、P30、P40、P50天取眼球和视神经。分别固定、脱水、石蜡包埋、切片。视网膜行HE染色；视神经分别行HE和Luxol Fast Blue染色。光镜观察。取P6、P15、P50正常及铅暴露仔鼠眼后极部视网膜、视神经，固定、超薄切片、染色，电镜观察。结果1、正常发育期大鼠视网膜形态学变化规律与发育成熟大鼠相比，新生大鼠视网膜总厚度较厚，随着发育视网膜总厚度逐渐变薄，从P3到P50视网膜总厚度减少约36.48％。其中内、外丛状层逐渐增厚，内丛状层出生时就已经存在，随着发育逐渐增厚，从P3到P50其厚度增加约36.31％，而外丛状层在生后第9天可以观察到，从P9到P50厚度增加约26.59％。神经节细胞层、内核层、外核层三个核层厚度均变薄，以内核层下降最明显，神经节细胞层从P3到P50厚度减少约39.03％，内核层、外核层从P9到P50厚度分别减少约55.52％和45.36％。各核层细胞数量也随发育发生相应的变化。神经节细胞数量从P3到P50减少约52.28％，内核层、外核层从P9到P50细胞数分别减少约40.56％和20.04％。三个核层细胞调亡高峰基本P20到P25之间。在新生大鼠视网膜只有两个核层，一是神经节细胞层，神经节细胞已经分化，另为视网膜原始神经母细胞层，在P9见到外丛状层将视网膜原始神经母细胞层分为内、外核层。视网膜原始神经母细胞层厚度从P3到P6三天减少约5.73％，相应原始神经母细胞数下降了3.41％。2、发育期低水平铅暴露大鼠视网膜形态学变化规律铅暴露仔鼠较正常仔鼠视网膜总厚度薄(P＜0.05)12.73％-24.15％，平均21.45％。外核层厚度比正常仔鼠薄(P＜0.05)8.13％-28.44％，平均15.61％，其相应的细胞数量减少了(P＜0.05)12.26％-28.47％，平均14.48％。在出生3、6天时的视网膜原始神经母细胞层比正常仔鼠变薄(P＜0.05)11.46％-19.91％，平均15.69％，相应的细胞数量减少(P＜0.05)16.19％-18.26％，平均17.23％。而铅对仔鼠视网膜节细胞层厚度及细胞数、内核层厚度及细胞数、内丛状层、外丛状层影响不大，均(P＞0.05)。正常仔鼠神经节细胞约P25凋亡趋于平缓，而低水平铅暴露大鼠神经节细胞则约P30凋亡趋于平缓。正常仔鼠内核层、外核层的细胞分别约P25、P30凋亡趋于平缓，而低水平铅暴露大鼠内核层、外核层的细胞则约P40凋亡趋于平缓。由此看出低水平铅暴露仔鼠视网膜细胞的凋亡明显时间延长。3、发育期正常大鼠视神经形态学变化规律正常仔鼠出生后随着出生天数的增加，视神经逐渐增粗，横截面积增大，在出生后的第3天至第15天增加幅度最大。神经胶质细胞数约在P15至P20达到顶峰，之后数量下降。视神经轴突髓鞘约在出生后第6天逐渐形成并随发育而增加，约在P30基本完成。4、发育期低水平铅暴露大鼠视神经形态学变化规律低水平铅暴露仔鼠视神经横断面积明显较正常仔鼠视神经横断面积要小(P＜0.05)，从P3到P50减少11.07％-29.15％，平均19.10％。铅暴露仔鼠视神经单位面积内轴突髓鞘所占比例减少(P＜0.05)，从P6到P50减少了24.30％-75.81％，平均41.54％，铅对髓鞘形成初期的影响比晚期要大。而低水平铅暴露仔鼠与正常仔鼠视神经胶质细胞数相比变化不大，说明铅对SD大鼠视神经胶质细胞数量没有影响，主要引起髓鞘的异常。5、正常与发育期低水平铅暴露仔鼠视网膜、视神经超微结构的变化仔鼠P6、P15、P50视网膜超微结构观察见：正常P6视网膜虽从光镜下不能分辨内核层与外核层细胞，仅统称为视网膜原始神经母细胞。但电镜下可见两个核层的细胞在细胞大小与着染程度明显不同，内核层细胞胞体大，长形，淡染。而外核层细胞相对胞体较小，圆，浓染。细胞之间的间隔较远，细胞排列较疏松。胞质中线粒体和高尔基复合体结构清。光感受器细胞外节膜盘结构清晰，排列整齐，内节线粒体嵴连续，呈长圆型，外核层细胞核形态规则，染色均匀，少量核固缩、调亡。P15、P50视网膜各层细胞排列均匀，致密。而低水平铅暴露仔鼠P6、P15、P50视网膜均见外核层核固缩明显，并见部分散在细胞空泡化、水肿。线粒体肿胀。细胞膜凹陷。核染色质固缩明显，向中央集中，部分核碎裂，形态不规则。光感受器外节膜盘肿胀模糊，部分叠状结构解离，排列不规整，间隙增大，内节线粒体肿胀呈球型，嵴断裂，有部分空泡变。内核层这种现象相对较少。说明铅更多破坏外核层的细胞。仔鼠P6、P15、P50视神经超微结构可见：正常P6视神经纤维由隔膜分成束状，每束包绕神经纤维多少不一，多数样本可见髓鞘出现，常见2-3层状髓鞘结构。P15、P50髓鞘变得越来越致密，轴突相对完整，微丝及微管清晰。神经胶质细胞着色均匀。低水平铅暴露仔鼠整体看神经较正常者细小。P6视神经轴突髓鞘基本未出现，极少轴突可见1-2层丝样髓鞘，说明铅可使髓鞘的形成延迟。P15、P50髓鞘相对正常少且薄。并见较多髓鞘松解，丝状或条索状脱离。偶见轴突空泡样变、崩解消失。微丝及微管结构较清晰。结论1、随着发育正常SD大鼠视网膜厚度变薄，三个核层细胞均存在生理性调亡。视神经逐渐增粗，在出生后的第3天至第15天增加幅度是最大的。大鼠视神经髓鞘约在出生后30天基本形成。2、低水平铅暴露使发育期视网膜、视神经发育异常延迟。改变视网膜、视神经的发育模式。3、低水平铅暴露使发育期视网膜细胞病理性凋亡，以外核层细胞为显著。4、低水平铅暴露使发育期视神经脱髓鞘、形成延迟。对轴突、微丝及微管结构影响不大。第三部分低水平铅暴露对发育期大鼠视网膜NMDA受体亚单位基因表达的影响目的应用半定量RT-PCR的方法研究正常及铅暴露组仔鼠不同发育时期视网膜NMDA受体亚单位的mRNA表达变化模式，了解铅暴露对视觉神经系统发育及可塑性的影响，探索铅对发育期视觉系统损害的机制。方法正常及铅暴露仔鼠于出生的P3、P6、P9、P12、P15、P20、P25、P30、P40、P50天时取视网膜。分别提取总RNA及合成cDNA，用NMDA-NR1，NMDA-2A，NMDA-2B为引物进行PCR扩增。产物电泳，Quantity One拍照，并分析。结果1、正常大鼠发育阶段视网膜NMDA受体亚单位基因表达模式SD大鼠发育时期视网膜NMDA-NR1 mRNA表达在出生的9-12天达到最高峰，之后，随着发育表达量逐渐减少；NMDA-2A mRNA表达约在出生时水平较低，随着发育逐渐升高；NMDA-2B mRNA表达在出生时水平较高，随着发育表达量逐渐下降。说明正常大鼠视网膜发育成熟过程也是由NMDA-2B逐渐向NMDA-2A转换的过程。2、铅暴露对大鼠发育阶段视网膜NMDA受体亚单位基因表达模式的影响铅暴露SD仔鼠发育时期视网膜NMDA-NR1 mRNA表达在出生时较低，随着发育缓慢升高，在出生的25天达到最高峰，之后，随着发育表达量逐渐减少。铅暴露使SD仔鼠发育时期视网膜NMDA-NR1 mRNA表达的最高峰期后延约13天。从出生3天至50天铅暴露SD仔鼠发育时期视网膜NMDA-NR1 mRNA表达均上调；铅暴露SD仔鼠发育时期视网膜NMDA-2A mRNA表达在出生时水平较低，随着发育逐渐升高，但升高较为平缓，在25天达到高峰，之后有下降趋势。铅暴露SD大鼠发育时期视网膜NMDA-2A mRNA表达从大约出生后25、30、40、50天下调；铅暴露SD仔鼠发育时期视网膜NMDA-2B mRNA表达在出生时水平相对较高，随着发育mRNA表达量仍保持在较高水平。铅暴露SD大鼠发育时期视网膜NMDA-2B mRNA表达在40、50天上调。由此看出铅暴露SD仔鼠视网膜NMDA-2A mRNA表达在发育过程中逐渐下调，而NMDA-2BmRNA表达随着发育mRNA表达量仍保持在较高水平。NMDA-2A与NMDA-2B比值减低了，铅暴露SD仔鼠NMDA受体亚单位的转型滞后，说明视网膜发育期延迟了。结论1、就视网膜NMDA受体而言，正常大鼠视网膜发育成熟过程也是由NMDA-2B逐渐向NMDA-2A转换的过程。2、铅暴露使发育期SD仔鼠视网膜NMDA受体亚单位的转型滞后，说明视网膜发育期延迟了。3、铅暴露使发育期SD大鼠视网膜NMDA受体表达异常。改变了NMDA的发育模式。4、铅暴露使发育期视网膜NR2A／NR2B比值减小以及NR1 mRNA表达增加说明铅刺激了NMDA受体活性的增加，使其保持发育状态。

全文目录

英文缩略语  3-4
中文摘要  4-10
英文摘要  10-19
课题研究背景  19-40
  一、铅的物理特性及在人体内的动态变化  20-21
  二、儿童铅暴露现状  21-22
  三、儿童铅暴露的来源及易感性  22-25
  四、铅暴露对发育期儿童健康的影响  25-27
  五、铅暴露作用机制  27-32
  六、铅暴露对视觉神经系统影响研究中仍存在的问题  32-33
  参考文献  33-40
第一部分…发育期低水平铅暴露动物模型的建立  40-50
  前言  40
  材料和方法  40-42
  结果  42
  讨论  42-47
  结论  47
  参考文献  47-50
第二部分…低水平铅暴露对发育期大鼠视网膜、视神经形态学影响  50-85
  前言  50-51
  材料和方法  51-55
  结果  55-78
  讨论  78-81
  结论  81
  参考文献  81-85
第三部分…低水平铅暴露对发育期大鼠视网膜NMDA受体亚单位基因表达的影响*  85-105
  前言  85-86
  材料和方法  86-88
  结果  88-96
  讨论  96-99
  结论  99-100
  参考文献  100-105
综述…低水平铅暴露对视觉系统的影响及作用机制  105-113
本课题的创新之处  113-114
  理论创新  113
  技术方法创新  113
  应用价值  113-114
攻读博士学位期间发表学术论文情况  114-115
致谢  115

低水平铅暴露对发育期大鼠视网膜、视神经的影响

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