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利用海带配子体营养增殖体系实现外源基因表达

作　者: 张亦陈
导　师: 秦松
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 海带(Laminaria japonica) 配子体生物反应器草丁膦 bar基因 egfp(增强型绿色荧光蛋白基因) rt-PA(瑞替普酶重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失突变体基因) actin(肌动蛋白基因) 启动子
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

1993年以来,本实验室在借鉴高等植物基因工程原理和方法的基础上,利用海带世代交替生活史,建立了海带遗传转化体系,并申请PCT专利(PCT/CN03/00534),相关成果已发表在Trends in Biotechnology(2005,23,264-268.)。海带遗传转化体系是建立在基因枪转化海带配子体,经孤雌或受精途径再生幼孢子体后用氯霉素筛选以及海上安全栽培等一系列技术平台上的新型体系。目前该体系已经成功实现报告基因(β-半乳糖苷酶基因,lacZ)和目的基因(乙肝表面抗原基因,HBsAg)在孢子体阶段的稳定表达。由于应用该体系表达目的基因须经过孢子体再生以及海上栽培等阶段,周期较长,因此本论文拟通过以下五方面工作初步建立以海带配子体营养增殖为基础的新型海带表达体系,并尝试利用该体系表达高附加值的目的基因。1)确立针对配子体的选择标记;2)利用光生物反应器增殖配子体;3)拓展新的报告基因种类;4)探索内源启动子;5)利用该体系表达rt-PA基因(编码价格昂贵的特效溶栓药,瑞替普酶)。本论文研究结果为:1)升高温度能够显著增强草丁膦的筛选效果,根据敏感性实验统计结果确定了草丁膦作为海带配子体遗传转化选择压力的筛选方案为40 mg/L连续处理7d×3次。2)利用室内光生物反应器营养增殖海带配子体技术,经草丁膦筛选,实现了SV40启动子驱动草丁膦抗性基因bar在配子体细胞中的稳定表达。3)采用调整配子体营养生长状态的方法减低背景荧光,从而首次观察到增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)在海带配子体细胞中的瞬间表达。

全文目录

第一章文献综述  8-38
  第一节原核微藻基因工程研究  10-17
  第二节真核微藻基因工程研究  17-22
  第三节大型海藻基因工程研究  22-26
  第四节海带基因工程研究  26-34
  第五节利用光生物反应器增殖转基因藻类研究  34-38
第二章海带配子体营养增殖表达体系的优化  38-79
  第一节海带配子体对不同选择压力的敏感性研究  40-47
    1 材料与方法  40-42
    2 结果  42-45
    3 讨论  45-46
    4 小结  46-47
  第二节草丁膦抗性基因(bar)在海带配子体中的稳定表达  47-61
    1 材料与方法  48-58
    2 结果  58-60
    3 讨论  60
    4 小结  60-61
  第三节增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)在海带配子体中的瞬间表达  61-70
    1 材料与方法  63-66
    2 结果  66-68
    3 讨论  68-69
    4 小结  69-70
  第四节海带肌动蛋白基因(actin)的克隆及序列分析  70-79
    1 材料与方法  71-74
    2 结果  74-78
    3 讨论  78
    4 小结  78-79
第三章瑞替普酶基因(rt-PA)在海带配子体中的表达研究  79-105
  第一节瑞替普酶基因(rt-PA)海带表达载体的构建  82-91
    1 材料与方法  82-86
    2 结果  86-89
    3 小结  89-91
  第二节瑞替普酶基因(rt-PA)在海带配子体中的稳定表达  91-105
    1 材料与方法  91-97
    2 结果  97-102
    3 讨论  102-104
    4 小结  104-105
结论  105-106
参考文献  106-119
发表文章目录  119-120
致谢  120

利用海带配子体营养增殖体系实现外源基因表达

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