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携带人白细胞介素10转基因小鼠的初步研究

作　者: 周鑫
导　师: 郑振宇
学　校: 河南农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 人白细胞介素10 乳腺生物反应器受精卵显微注射
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)是免疫系统的一个重要调节因子,主要由Th2细胞产生,是细胞因子中唯一具有免疫下调作用的细胞因子,且具有广泛的生物学活性,包括免疫抑制、抗炎症及免疫调节特性,主要功能是限制和终止炎症反应,调节多种免疫细胞的分化和增殖,清除感染颗粒。研究表明,人白细胞介素10(hIL-10)在炎症、恶变、自身免疫性疾病、肿瘤、移植排斥反应等多种疾病的发生和发展过程中都有重要的免疫调节作用。hIL-10在临床上广泛应用于急性肺损伤、炎症性肠病、实验性脓毒败血症休克、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、丙型肝炎、再灌注损伤等疾病的治疗。动物乳腺反应器是1989年美国人Gordon发明的,该技术利用转基因技术实现外源基因在动物乳腺特异性表达,具有产出蛋白生物活性高、纯化简单、成本低、对环境没有任何污染等优点,广泛应用于药用蛋白的生产。为了构建hIL-10乳腺特异表达载体,研发能够稳定表达hIL-10的乳腺生物反应器,本研究以牛、人全基因组DNA为模板,通过PCR克隆了牛β-酪蛋白(bβ-CN)基因5′调控区序列和hIL-10基因,将bβ-CN 5′调控区序列和hIL-10连接入pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建出携带hIL-10的重组质粒pcDNA3.1(+)-bβCN-hIL-10。利用显微注射法将Bst1107 I单酶切线性化pcDNA3.1(+)-bβCN-hIL-10质粒导入受精卵雄原核,并将正常胚胎移入受体雌鼠子宫。试验结果如下:1.hIL-10基因的克隆参照Genbank中注册的X78437 hIL-10基因序列设计引物,运用PCR技术,以人全基因组DNA为模板,扩增片段长1993bp。将扩增产物与pUM-T连接,构建重组质粒pUM-hIL-10,经PCR、酶切及序列测定表明,扩增序列成功插入pUM-T,且该序列与X78437同源性达到99.19%,成功克隆出hIL-10基因。2.牛β-CN基因5′调控序列的克隆参照Genbank中注册的X14711 bβ-CN序列设计引物,运用PCR技术,以荷斯坦奶牛全基因组DNA为模板,扩增长3165bp的奶牛β-酪蛋白5′调控序列。将扩增产物与pUM-T连接,构建重组质粒pUM-bβ-CN,经PCR、酶切及序列测定表明,扩增序列成功插入pUM-T,且该序列与X14711的同源性达98.29%,成功克隆bβ-CN 5′调控区序列。3.重组质粒pcDNA3.1(+)-bβCN-hIL-10的构建将pUM-hIL-10用BamH I和Not I双酶切,回收小片段,定向克隆至经同样酶切处理的质粒pcDNA3.1(+),构建表达载体pcDNA3.1(+)-hIL-10;将pUM-bβ-CN用Kpn I和BamH I双酶切,回收大片段,定向克隆至经同样酶切处理的质粒pcDNA3.1(+)-hIL-10,构建出pcDNA3.1(+)-bβCN-hIL-10质粒。经PCR和双酶切鉴定,结果表明,hIL-10、bβ-CN 5′调控序列基因插入到pcDNA3.1(+)中。4.显微注射及胚胎移植选择13只雌鼠进行超数排卵,合笼后次日早上检查阴栓,将6只有阴栓雌鼠进行解剖并采集受精卵,获得发育正常、原核清晰的受精卵170枚;通过显微注射法将纯化的pcDNA3.1(+)-bβCN-hIL-10线性化片段注射入受精卵雄原核中,经体外培养后,有113枚胚胎正常发育至桑葚胚或囊胚,发育率达66.5%,证明本试验构建的真核表达载体对胚胎发育的影响较小,具有一定的生物安全性。

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致谢 4-9摘要 9-111. 文献综述 11-22 1.1 白细胞介素10（IL-10）研究进展 11-16 1.1.1 IL-10 分子结构和来源 11-12 1.1.2 IL-10 基因调控机理 12 1.1.3 IL-10 基因表达的调控 12 1.1.4 IL-10 的信号传导 12-13 1.1.5 IL-10 的生物学功能 13-14 1.1.5.1 IL-10 对B 淋巴细胞的作用 13 1.1.5.2 IL-10 对T 淋巴细胞的作用 13-14 1.1.5.3 IL-10 对调节性T 淋巴细胞作用 14 1.1.5.4 IL-10 对单核/巨噬细胞的作用 14 1.1.6 IL-10 在疾病治疗方面的研究 14-15 1.1.7 IL-10 应用前景与面临问题 15-16 1.2 乳腺生物反应器研究进展 16-22 1.2.1 转基因技术 16 1.2.2 乳腺生物反应器 16-17 1.2.3 乳腺生物反应器的构建 17-19 1.2.4 常用的基因转移技术 19-20 1.2.4.1 显微注射法 19-20 1.2.4.2 反转录病毒感染技术 20 1.2.4.3 雄性生殖细胞转染技术 20 1.2.5 乳腺生物反应器的应用现状 20-21 1.2.6 乳腺生物反应器研究的问题与展望 21-222. 引言 22-233 人白细胞介素10 基因的克隆 23-30 3.1 试验材料 23-24 3.1.1 主要试剂和材料 23 3.1.2 主要仪器 23 3.1.3 常用试剂配制 23-24 3.2 试验方法 24-27 3.2.1 PCR 引物的设计与合成 24 3.2.2 PCR 反应 24-25 3.2.3 PCR 产物的回收和纯化 25 3.2.4 hIL-10 与pUM-T 连接 25 3.2.5 重组质粒的转化 25-26 3.2.6 重组质粒pUM-hIL-10 的筛选与PCR 鉴定 26 3.2.7 pUM-hIL-10 的酶切鉴定及测序 26-27 3.3 结果与分析 27-29 3.3.1 hIL-10 的PCR 扩增结果 27 3.3.2 重组质粒pUM-hIL-10 的筛选与鉴定 27-29 3.4 小结 29-304 牛β酪蛋白基因5′端调控序列的克隆 30-35 4.1 试验材料 30 4.1.1 主要试剂和材料 30 4.1.2 主要仪器 30 4.1.3 常用试剂配制 30 4.2 试验方法 30-32 4.2.1 PCR 引物的设计与合成 30 4.2.2 牛血液DNA 提取 30-31 4.2.3 PCR 反应 31 4.2.4 PCR 产物的回收和纯化 31 4.2.5 牛β-CN 与pUM-T 连接 31 4.2.6 重组质粒的转化 31 4.2.7 重组质粒的筛选与PCR 鉴定 31 4.2.8 pUM-bβCN 的酶切鉴定及测序 31-32 4.3 结果与分析 32-34 4.3.1 牛血液DNA 的提取 32 4.3.2 牛β酪蛋白基因5′端调控序列的PCR 扩增 32 4.3.3 重组质粒pUM-hIL-10 的筛选与鉴定 32-34 4.4 小结 34-355 真核表达载体的构建 35-39 5.1 试验材料 35 5.1.1 主要试剂和材料 35 5.1.2 主要仪器 35 5.1.3 常用试剂配制 35 5.2 试验方法 35-36 5.2.1 hIL-10 与pcDNA3.1(+)质粒载体连接 35 5.2.2 pcDNA3.1(+)-hIL-10 连接产物的筛选及鉴定 35 5.2.3 bβCN 与pcDNA3.1(+)-hIL-10 质粒载体连接 35-36 5.2.4 pcDNA3.1(+)-bβCN-hIL-10 连接产物的筛选及鉴定 36 5.3 结果与分析 36-38 5.3.1 重组质粒pcDNA3.1(+)-hIL-10 的鉴定 36-37 5.3.2 重组质粒pcDNA3.1(+)-bβCN-hIL-10 的鉴定 37-38 5.4 小结 38-396 转基因小鼠的构建 39-47 6.1 试验材料 39-40 6.1.1 实验动物 39 6.1.2 主要试剂和材料 39 6.1.3 主要仪器 39 6.1.4 常用试剂配制 39-40 6.2 试验方法 40-44 6.2.1 雄鼠的结扎 40-41 6.2.2 超排小鼠和假孕小鼠的准备 41 6.2.3 受精卵采集及观察 41-42 6.2.4 显微注射 42-44 6.2.4.1 显微注射准备 42 6.2.4.2 受精卵的显微注射 42-44 6.2.5 胚胎移植 44 6.2.5.1 准备移植胚胎 44 6.2.5.2 胚胎的子宫移植 44 6.2.5.3 复苏 44 6.3 结果与分析 44-46 6.3.1 原核期胚胎的形态学观察与采集 44-45 6.3.2 显微注射及胚胎移植结果 45-46 6.4 小结 46-477 讨论与结果 47-49 7.1 讨论 47-48 7.1.1 目的基因的选择 47 7.1.2 DNA 结构、纯度、浓度对基因转移的的影响 47 7.1.3 显微注射对基因转移的的影响 47-48 7.1.4 胚胎移植对基因转移的的影响 48 7.2 结论 48-49参考文献 49-56Abstract 56-57

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