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库尔勒香梨和葡萄病毒分子检测技术研究

作　者: 牛建新
导　师: 吴禄平；张志宏
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 果树学
关键词: 库尔勒香梨 葡萄 病毒 RT-PCR 内标 cDNA 探针 原位PCR
分类号: S436.631.1
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


本研究主要包括葡萄病毒RT-PCR 和多重RT-PCR 检测技术、库尔勒香梨RT-PCR 检测技术和多重RT-PCR 检测技术、cDNA 探针检测技术、原位RT-PCR 检测技术等检测体系的建立和优化。1.以葡萄叶片和皮层为材料,对植物总RNA 和dsRNA 提取方法进行了研究,从中筛选出了适合葡萄总RNA 和dsRNA 的提取方法。建立了GLRaVⅢ和GFLV 的有效RT-PCR 体系,在有效体系基础上,通过研究RT-PCR 主要成分对RT-PCR 的影响,确立了GLRaVⅢ和GFLV 的RT-PCR 的优化体系。在确立葡萄GLRaVⅢ和GFLVRT-PCR 优化体系基础上,研究了多重PCR 的主要成分:dNTPS、Taq DNA 聚合酶、MgCl2对PCR 反应的影响,从而确立了GLRaV Ⅲ、GFLV 的多重RT-PCR 检测体系。2.以库尔勒香梨叶片和皮层为材料,对7 种总RNA 提取方法进行了研究,从中筛选出了适合库尔勒香梨总RNA 的提取方法。并根据梨组织富含多糖、酚类物质的特点,改进了提取方法。结果表明,要获得良好的RT-PCR 扩增,RT 体系中dNTPs 浓度、互补引物、AMV、模板的浓度要分别达到0.1mmol·L-1、0.2μmol·L-1、0.05U·μL-1、0.01μg·μL-1 以上;此外,使用RNasin能有效抑制RT 体系中RNase 对病毒RNA 的降解作用,可使RT 过程顺利进行;PCR 体系中dNTPs 浓度至少要达到0.1mmol·L-1,0.2～0.3mmol·L-1可以获得最佳的扩增效果;Taq E 浓度要达到0.015U·μL-1以上;引物浓度适宜范围0.3～0.7μmol·L-1;Mg2+要达到1.26mmol·L-1以上。3.利用nad5 基因作为内标系统,研究建立了库尔勒香梨上ASPV、ACLSV、ASGV 等病毒的RT-PCR 检测技术,在此基础上研究建立了库尔勒香梨多重RT-PCR 内标检测系统。并对回收的特异片段进行了克隆、鉴定和测序。

全文目录


中文摘要  15-17
缩略词  17-19
前言  19-46
  1 果树病毒的危害及特点  19-21
  2 病毒病的研究概况  21-26
  3 果树病毒病的检测技术  26-46
    3.1 外观症状诊断法  26
    3.2 指示植物检测法  26-27
    3.3 电子显微镜检测  27
    3.4 血清学检测法  27-28
    3.5 分子生物学检测法  28-43
      3.5.1 核酸分子杂交技术  29-32
      3.5.2 多聚酶链式反应技术  32-36
      3.5.3 双链RNA技术  36-38
      3.5.4 原位PCR技术  38-43
    4 我国果树病毒病的研究存在的问题和发展趋势  43-46
第一部分:葡萄主要病毒 RT-PCR 检测技术研究  46-70
  1 材料和方法  46-50
    1.1 供试材料  46
    1.2 供试试剂  46-47
    1.3 实验方法  47-50
      1.3.1 总RNA的提取方法  47-48
      1.3.2 总RNA的纯化  48
      1.3.3 总 RNA 完整性和含量检测  48
      1.3.4 GLRaV Ⅲ、GFLV 有效RT-PCR 体系的建立  48-49
      1.3.5 GLRaV、GFLV RT-PCR 体系的优化  49
      1.3.6 PCR 产物的电泳分析  49
      1.3.7 葡萄样品的带毒情况测定  49-50
  2 结果与分析  50-68
    2.1 葡萄组织中总RNA完整性检测  50-51
    2.2 葡萄组织中总 RNA 的纯度  51-52
    2.3 GLRaV Ⅲ、GFLV 有效 RT-PCR 体系的建立  52-53
      2.3.1 GLRaV Ⅲ有效 RT-PCR 体系  52
      2.3.2 GFLV 有效RT-PCR 体系  52-53
    2.4 GLRaV RT-PCR 体系优化  53-60
      2.4.1 RT 成分和时间对 GLRaV Ⅲ RT 的影响  53-57
      2.4.2 GLRaV Ⅲ PCR 体系各反应成分的浓度对 PCR 扩增的影响  57-60
      2.4.3 GLRaV Ⅲ RT-PCR 优化体系  60
    2.5 GFLV RT—PCR 体系优化  60-64
      2.5.1 RT 主要成分对GFLV RT 的影响  60-61
      2.5.2 GFLV PCR 体系各反应成分的浓度对 PCR 扩增的影响  61-64
      2.5.3 GFLV RT-PCR 的优化体系  64
    2.6 GLRaV Ⅲ、GFLV 多重 RT—PCR  64-68
      2.6.1 GLRaV Ⅲ、GFLV 多重 RT—PCR 体系的建立  64-65
      2.6.2 GLRaV Ⅲ、GFLV 多重RT-PCR 体系优化分析  65-67
      2.6.3 GLRaV Ⅲ、GFLV 多重 RT—PCR 优化体系  67-68
    2.7 样品带毒率检测结果  68
  3 讨论  68-70
    3.1 关于总RNA 及dsRNA 的提取  68
    3.2 PCR 反应的优化与设计  68-69
    3.3 关于多重 RT-PCR  69-70
第二部分:库尔勒香梨主要病毒 RT-PCR 检测技术研究  70-114
  1 材料与方法  70-83
    1.1 材料  70
      1.1.1 供试材料  70
      1.1.2 菌株  70
      1.1.3 质粒  70
    1.2 供试试剂  70-72
      1.2.1 试剂和酶类  70-71
      1.2.2 引物  71-72
    1.3 实验方法  72-83
      1.3.1 RT-PCR 的实验方法  72-75
        1.3.1.1 总 RNA 提取方法  72-73
        1.3.1.2 dsRNA 提取方法  73
        1.3.1.3 总RNA的纯化  73
        1.3.1.4 dsRNA、总 RNA 含量、纯度和完整性检测  73-74
        1.3.1.5 PVYV(ASPV)、ACLSV 有效 RT-PCR 体系的建立  74
        1.3.1.6 PVYV(ASPV)、ACLSV RT-PCR 体系的优化  74
        1.3.1.7 PCR 产物的电泳分析  74-75
      1.3.2 内标多重 RT-PCR 实验方法  75-83
        1.3.2.1 梨组织中总RNA的提取  75-76
        1.3.2.2 梨组织中总核酸的提取  76-77
        1.3.2.3 库尔勒香梨病毒RT-PCR检测体系  77-78
        1.3.2.4 库尔勒香梨病毒多重RT-PCR检测体系的建立  78-79
        1.3.2.5 目的基因转化大肠杆菌  79-82
        1.3.2.6 序列测定与分析  82-83
  2 结果与分析  83-109
    2.1 dsRNA、总RNA 的纯度和浓度  83
    2.2 总 RNA、dsRNA 的电泳检测  83-85
    2.3 梨组织总核酸的提取  85-86
    2.4 dsRNA、总RNA RT-PCR 活性检验  86-87
    2.5 PVYV(ASPV)和 ACLSV dsRNA、总 RNA RT-PCR 有效体系  87-88
      2.5.1 PVYV(ASPV)dsRNA、总RNA RT-PCR 有效体系  87-88
      2.5.2 ACLSV dsRNA、总RNA RT-PCR 有效体系  88
    2.6 PVYV RT-PCR 体系的优化  88-97
      2.6.1 RT 成分浓度对PVYV RT 的影响  88-93
      2.6.2 PVYV PCR 体系各反应成分的浓度对 PCR 扩增的影响  93-96
      2.6.3 PVYV(ASPV) RT-PCR 优化体系  96-97
    2.7 ACLSV RT-PCR 检测方法的优化  97-100
      2.7.1 RT 成分浓度对ACLSV RT 的影响  97-98
      2.7.2 ACLSV PCR 检测各反应成分的的浓度对PCR 扩增的影响  98-100
      2.7.3 ACLSV RT-PCR 优化体系  100
    2.8 库尔勒香梨病毒多重 RT-PCR 检测体系的建立  100-104
      2.8.1 库尔勒香梨病毒RT-PCR检测体系  100-101
      2.8.2 内标体系的建立  101-103
      2.8.3 多重 RT-PCR 体系  103-104
    2.9 RT-PCR 产物的转化、筛选和鉴定  104-106
    2.10 目的片段的序列分析与比较  106-109
  3 讨论  109-114
    3.1 关于总 RNA 的提取  109-111
    3.2 PCR 体系的建立和优化  111-112
    3.3 库尔勒香梨病毒的多重 RT-PCR 检测体系  112-114
第三部分:库尔勒香梨主要病毒cDNA 探针检测技术研究  114-132
  1 材料和方法  114-118
    1.1 供试材料  114
    1.2 供试试剂  114-115
    1.3 实验方法  115-118
      1.3.1 总RNA提取方法  115-116
      1.3.2 总 RNA 的纯化  116
      1.3.3 总RNA 含量、纯度和完整性检测  116
      1.3.4 ASPV、ACLSV 生物素标记的cDNA 探针的合成  116-117
      1.3.5 探针显色灵敏度的检测  117
      1.3.6 ASPV、ACLSV 斑点杂交检测有效体系的建立  117-118
      1.3.7 ASPV、ACLSV 斑点杂交检测体系的优化  118
      1.3.8 对不同样品检测效果比较  118
      1.3.9 不同杂交膜比较  118
      1.3.10 不同封闭剂对杂交信号检测影响  118
      1.3.11 田间样品的带毒情况检测  118
  2 结果与分析  118-129
    2.1 总 RNA 的纯度和浓度  118-119
    2.2 总 RNA 的完整性  119
    2.3 生物素标记的标记cDNA 探针的鉴定  119-121
      2.3.1 ASPV cDNA 探针电泳鉴定  119-120
      2.3.2 ACLSV cDNA 探针电泳鉴定  120-121
    2.4 ASPV、ACLSV 生物素标记探针显色灵敏度的检测  121
    2.5 ASPV、ACLSV 斑点杂交检测有效体系的建立  121-122
    2.6 ASPV 斑点杂交检测体系的优化  122-124
      2.6.1 反应温度对ASPV斑点杂交反应的影响  122
      2.6.2 反应时间对ASPV斑点杂交反应的影响  122-123
      2.6.3 探针浓度对ASPV斑点杂交反应的影响  123-124
      2.6.4 甲酰胺浓度对ASPV斑点杂交反应的影响  124
    2.7 ACLSV 斑点杂交检测体系的优化  124-127
      2.7.1 反应温度对 ACLSV 斑点杂交反应的影响  124-125
      2.7.2 反应时间对 ACLSV 斑点杂交反应的影响  125
      2.7.3 探针浓度对 ACLSV 斑点杂交反应的影响  125-126
      2.7.4 甲酰胺浓度对 ACLSV 斑点杂交反应的影响  126-127
    2.8 不同组织和提取方法对病毒检测效果的影响  127-128
      2.8.1 不同组织和提取方法对ASPV检测效果的影响  127
      2.8.2 不同组织和提取方法对 ACLSV 检测效果的影响  127-128
    2.9 不同杂交膜对杂交检测效果影响  128
    2.10 不同封闭剂对杂交检测效果影响  128-129
    2.11 样品检测结果  129
  3 讨论  129-132
    3.1 斑点杂交检测优化体系的建立和优化  129-130
    3.2 cDNA 探针检测的可靠性和灵敏度  130-131
    3.3 生物素标记的cDNA探针的应用  131-132
第四部分:应用原位 RT-PCR 技术检测果树病毒的方法学研究  132-147
  1 材料和方法  132-135
    1.1 供试材料  132
    1.2 试剂  132-133
    1.3 试验方法  133-135
      1.3.1 石蜡切片制作  133
      1.3.2 切片预处理  133
      1.3.3 cDNA 合成  133-134
      1.3.4 原位扩增  134
      1.3.5 原位 PCR 产物的免疫检测  134
      1.3.6 对照的设置  134-135
    1.4 不同预处理效果研究  135
      1.4.1 果胶酶处理时间对原位切片效果的影响  135
      1.4.2 蛋白酶处理时间原位切片效果的影响  135
    1.5 碱性磷酸酶显色系统可靠性实验  135
    1.6 PBS 和 DEPC 处理水冲洗对消除蛋白酶K 和DNA 酶效果研究  135
    1.7 有效RT反应体系的建立  135
    1.8 扩增中各因素对试验结果影响的研究  135
  2 结果与分析  135-144
    2.1 预处理对原位切片效果的影响  135-136
      2.1.1 果胶酶处理时间的影响  135-136
      2.1.2 蛋白酶处理时间的影响  136
    2.2 碱性磷酸酶显色系统可靠性实验结果  136-137
    2.3 PBS 和 DEPC 处理水冲洗对消除蛋白酶K 和DNA 酶效果  137
    2.4 苹果褪绿叶斑病毒在组织中的分布  137-138
    2.5 RT 组分浓度对原位PCR 效果的影响  138-140
      2.5.1 RNasin 浓度的影响  138
      2.5.2 dNTPs 浓度对扩增效果的影响  138-139
      2.5.3 AMV 浓度对 RT 效果的影响  139-140
      2.5.4 引物浓度对结果的影响  140
    2.6 原位扩增中各因素对 PCR 效果的影响  140-144
      2.6.1 退火温度对 PCR 的影响  140-141
      2.6.2 循环次数对原位 PCR 效果的影响  141-142
      2.6.3 引物浓度对原位 PCR 效果的影响  142
      2.6.4 Taq 浓度对 PCR 的影响  142-143
      2.6.5 Mg~(2+)量对原位PCR效果的影响  143-144
  3 讨论  144-147
    3.1 固定剂的选用与固定时间的确定  144
    3.2 蛋白酶消化时间的确定  144-145
    3.3 地高辛标记核苷酸的使用  145
    3.4 原位 PCR 的反应体系各组分对结果的影响  145-146
    3.5 原位 PCR 检测梨病毒的敏感性与特异性  146-147
结论  147-148
参考文献  148-158
附录  158-166
英文摘要  166-169
攻读博士学位论文期间发表的文章目录  169-171
致谢  171-172
论文图表统计  172

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