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禽腺病毒载体的构建及其生物学特性的研究

作　者: 何秀苗
导　师: 秦爱建
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 重组禽腺病毒 FAVI-JS 分离鉴定复制非必需片段致病性通用型转移载体新城疫 F蛋白
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

根据群特异性抗原的不同，禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAV)属可分为3群：Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群，其中Ⅰ群禽腺病毒包括从鸡、火鸡、鹅及其它禽类分离获得的腺病毒。尽管Ⅰ群禽腺病毒的病原性大多尚未确定，但是往往与其他病原感染后的继发感染密切相关。在免疫学上，Ⅰ群禽腺病毒能诱导感染鸡产生高水平的中和性循环抗体；即使在高水平循环抗体存在的背景下，宿主仍然可受到病毒的再次感染，病毒在局部黏膜系统长期复制并且持续排毒。因此，Ⅰ群禽腺病毒有望作为良好的、可持续复制的活病毒载体侯选病毒。国外在Ⅰ群禽腺病毒载体方面已有初步的研究，但离临床应用还有很大的距离，国内在这方面的研究几乎是个空白。人腺病毒载体研究较多，其基因组的E1、E3区和E4区上游是腺病毒最常用的外源基因插入位点。但是，由于FAV与人腺病毒的基因组结构有差异，与人腺病毒E1、E3区和E4区相应的位点在FAV基因组的定位还未清楚，因此复制非必需片段的筛选策略对于将禽腺病毒构建成病毒活载体至关重要。本研究从健康鸡群中分离出一株Ⅰ群禽腺病毒，并对其复制非必需片段进行了鉴定；对表达增强型绿色荧光蛋白eGFP的重组病毒的致病性进行了初步的研究，探讨了该毒株作为外源基因表达性载体的可行性，同时将新城疫病毒等重要病原的保护性抗原基因插入载体并获得了表达。一、Ⅰ群禽腺病毒江苏分离株(FAVI-JS)的分离鉴定通过形态学、病毒特性、致细胞病变和序列比较等方法对从健康鸡群中分离出的一株疑为Ⅰ群禽腺病毒FAVI-JS进行了鉴定。试验结果表明：该病毒为球形、无囊膜，直径为70～80nm；不具有凝集鸡、鸭、鹅红细胞的能力，但可以凝集大鼠红细胞；在鸡胚肾细胞(CEK)上可致细胞变圆，折光性增强等病变；通过PCR方法扩增并测定了FAVI-JS株的L、R、ITR三个片段，经过与同属血清Ⅰ型的CELO病毒、FAV-1、FAV-A和血清8型的禽腺病毒(FAV-8)基因组的相应序列比较，发现，FAVI-JS与Ⅰ群禽腺病毒各毒株在上述三个片段上同源性都很高，其中与血清1型的同源性高达96％以上。根据对腺病毒分类具有重要意义的ITR序列所绘制的遗传进化树，FAVI-JS与Ⅲ群禽腺病毒EDS、Y81G4株明显属于不同的分支，而与Ⅰ群禽腺病毒，特别是与血清Ⅰ型的禽腺病毒更接近。这些结果证明，FAVI-JS确为Ⅰ群禽腺病毒。二《X)四年扬州大学博士学位论文二、禽腺病毒江苏株(FAVI一S)复制非必需片段的确定利用PCR方法从上述I群禽腺病毒FAVI一Js分离株中扩增出其基因组的两侧末端片段:左侧末端片段(L片段)、右侧次末端片段(R片段)、以及右侧末端的ITR片段，然后将L片段、R片段和ITR片段同时以串联子形式克隆进粘粒载体pHC中，获得重组质粒pHC一FAvl一R一I双一L，再在该克隆的R片段和ITR片段之间插入增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因，获得转移质粒载体PFAVI.eGFP。将pFAVI一eGFP转染己被野生型(wt)FAVI一Js分离株感染的鸡胚肾细胞进行同源重组，通过有限稀释法筛选重组病毒，并通过病毒蚀斑技术纯化重组病毒，结果获得了表达增强型绿色荧光蛋白的重组I群禽腺病毒r孙汉I一eGFP，证明位于基因组右末端R片段和ITR片段之间的位点为病毒复制非必需区。对rFAVI一eGFP的特性进行研究发现，重组病毒r侧汉I一eGFP具有凝集大鼠红细胞的特性，在形态上与野生病毒FAVI一JS没有区别;r称戊I一GFP在CEK上盲传20代后，其荧光强度与初代没有显著差别，通过病毒蚀斑试验，也没有发现野生病毒斑的形成:此外，r凡份I一eGFP在CEK上的生长曲线与野生病毒FAVI一Js基本相似;这些结果证实，该重组病毒是稳定遗传的，具有野生病毒的特性。此外，r砂印I一eGFP可以通过鸡胚进行大量繁殖，而且尿囊腔途径比绒毛尿囊膜途径的病毒滴度高。这些结果为禽腺病毒重组基因工程疫苗的研究奠定了基础。三、表达增强型绿色荧光蛋白重组禽腺病毒的复制性及其致病性初步研究本研究进一步对重组病毒rFAVI一eGFP的体内复制情况和对SPF鸡的致病性进行了初步的探讨。在第一批试验中，用IOSTclDS。的病毒剂量、以皮下接种途径将FAVI一JS和:FAVI一eGFP分别感染1日龄和10日龄SPF鸡，通过IFA方法和ELISA方法检测接种鸡体内的抗体水平的差异。结果表明，rFAVI一eGFP组的抗体水平与FAVI一JS组相当，rFAVI一eGFP组和FAVI一Js组无论是在1日龄接种还是10日龄接种，抗体在机体内的维持时间均较长:在1日龄组，FAVI一Js于接种后81天ELISA检测的P入值大于7，rFAVI一eGFP于接种后62天ELisA检测的P入值大于5;在10日龄组，两者在接种后74天ELISA检测的P加值大于6以上。在检测中发现，EUSA的敏感性比IEA高。第二批试验通过肌肉和口服两种途径，分别以105、1 09、10’“个TCIDS。剂量的亦AvLeGFP接种10日龄sPF雏鸡，通过病毒分离方法检测泄殖腔排毒情况，同时以正A方法和EUSA方法检测接种鸡体内的抗体水平及其动态。结果显示，SPF鸡于接种后第七天即可检测到泄殖腔排毒和正A及ELisA反应阳性抗体;抗体在接种后8周仍维持较高水平，其EUSA检测的P加值大于7以上。体外中和试验表明，机体内产生的抗体对r曰戊I一eGFP具有中和效应。从

全文目录

中文摘要  3-6
英文摘要  6-11
符号说明  11-13
第一部分文献综述   13-69
  腺病毒载体的研究进展  14-69
    一、腺病毒分子生物学特性  14-18
    二腺病毒载体的构建基础  18-26
    三腺病毒载体的构建方法  26-30
    四腺病毒载体的优缺点  30-33
    五腺病毒载体的研究  33-57
    六腺病毒载体在临床应用中遇到的问题及展望  57-69
第二部分论文研究  69-149
  研究一 Ⅰ群禽腺病毒江苏分离株(FAVI-JS)的分离鉴定  70-87
  研究二禽腺病毒江苏株(JS)复制非必需片段的确定  87-105
  研究三表达增强型绿色荧光蛋白的重组禽腺病毒的复制性与其致病性初步研究  105-121
  研究四 FAVI-JS通用型转移载体的构建  121-135
  研究五表达新城疫病毒F48E8融合蛋白基因的重组禽腺病毒的构建  135-149
主要研究成果  149-150
攻读博士学位期间发表的学术论文  150-151
致谢  151

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