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稻瘟病菌转录因子Moswi6的功能研究

作　者: 王琦
导　师: 张正光
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: MAPK Moswi6 细胞壁完整性致病性
分类号: S435.111.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

稻瘟病是影响全球水稻产量的重要病害,其病原真菌(Magnaporthe oryzae)与水稻的互作系统已成为研究植物病原真菌与寄主互作较为理想的模式系统之一,稻瘟病菌也是研究丝状真菌生长发育和侵染致病机制的重要模式生物。转录因子是基因表达调控的关键因子,从研究转录因子的功能入手来解析稻瘟病菌生长发育与致病性过程中的分子机制具有重要意义,可以为寻找新的稻瘟病菌杀菌剂作用靶标,设计新的稻瘟病控制策略提供理论依据。真核生物中,促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase, MAPK)途径是一类重要的细胞信号转导途径。模式真菌酵母中,SLT2 MAPK信号通路参与调控细胞壁完整性和氧胁迫。而真菌的细胞壁是很多抗真菌的药物靶标,因此对于这条MAPK信号通路,特别是这条通路下游转录因子的深入研究可能有助于病害的防治研究。SLT2在稻瘟病菌中的同源基因是Mpsl,该基因的缺失影响产孢、附着胞形成和致病性。酵母中,Swi6是SLT2下游的转录因子,本文根据同源序列比对,在稻瘟病菌基因组数据库中搜索到一个与酵母Swi6同源的基因,并命名为Moswi6.序列分析表明该基因编码的蛋白含有806个氨基酸,该蛋白包含一个APSES结构域和一个ANKrepeats结构域。Sourthern杂交显示该基因在稻瘟病菌基因组中为单拷贝。酵母双杂交实验表明该基因能够与其上游Mpsl互作,证明该基因是Mps1 MAPK下游转录因子。本文采用原生质体转化和同源重组技术获得了稻瘟病菌的Moswi6敲除突变体,并对其各种生物学表型进行了分析。研究表明Moswi6敲除突变体生长速率减慢、孢子萌发及附着胞形成阶段均有缺陷；附着胞内膨压减小；Moswi6敲除突变体对金属离子、SDS、渗透压等细胞壁相关的胁迫耐受性增强；对菌丝进行CFW染色显示突变体的细胞壁几丁质分布发生变化,形成很多菌丝膨大体。荧光定量PCR检测突变体内几丁质合酶表达量的变化,表明几丁质合酶表达量显著升高；进一步分析发现,突变体对外源氧胁迫更敏感,胞内过氧化物酶和胞内漆酶活性均显著降低。而加入细胞壁降解酶或者外源铜离子均可以提高菌丝的色素积累,使菌丝膨大体恢复成正常的菌丝形态,因此,Moswi6影响细胞壁完整性。水稻叶片离体和喷雾接种发现突变体均不能侵染水稻。因此,Moswi6基因在稻瘟病菌生长发育和致病性方面起重要作用。

全文目录

摘要 7-8ABSTRACT 8-11上篇文献综述 11-31 第一章稻瘟病菌转录因子研究概况 11-23 1 真核生物转录因子概况 11-12 2 与DNA结合的转录因子家族 12-13 2.1 螺旋-转角-螺旋 12 2.2 锌指结构 12-13 2.3 亮氨酸拉链 13 2.4 螺旋-环-螺旋 13 3 转录因子在稻瘟病菌生长发育和致病性中的功能研究 13-17 3.1 螺旋-转角-螺旋类转录因子 14-15 3.2 锌指类转录因子 15 3.3 亮氨酸拉链类转录因子 15-16 3.4 螺旋-环-螺旋类转录因子 16 3.5 其他家族转录因子的研究 16-17 参考文献 17-23 第二章植物病原真菌MAPK信号通路研究概况 23-31 1 植物病原真菌MAPK的种类和功能 23-25 1.1 调节交配信息素反应的MAPK信号途径 23-24 1.2 与细胞壁完整性相关的MAPK信号通路 24 1.3 与渗透压相关的MAPK信号通路 24-25 2 稻瘟病菌中MAPK信号途径相关研究 25-27 2.1 PMK1 MAPK信号通路 25-26 2.2 MPS1 MAPK信号通路 26 2.3 OSM1 MAPK信号通路 26-27 3 SLT2信号通路在其他植物病原真菌中的研究 27 参考文献 27-31下篇研究内容 31-69 稻瘟病菌转录因子Moswi6的功能研究 33-69 1 材料与方法 34-43 1.1 稻瘟病菌供试菌株及培养条件 34-35 1.2 稻瘟病菌DNA、RNA的提取和cDNA的合成 35 1.3 Moswi6基因的克隆及序列分析 35-36 1.3.1 Moswi6基因的克隆 35 1.3.2 Moswi6基因的拷贝数分析 35 1.3.3 稻瘟病菌Moswi6蛋白的序列分析和系统发育分析 35-36 1.4 酵母双杂交实验 36-37 1.4.1 酵母菌株、质粒及培养条件 36 1.4.2 酵母双杂载体构建 36-37 1.4.3 共转化 37 1.4.4 β-半乳糖苷酶的定性分析 37 1.5 Moswi6基因敲除突变体的获得 37-39 1.5.1 Moswi6基因敲除载体的构建 37-38 1.5.2 Moswi6敲除突变体的筛选及验证 38 1.5.3 Moswi6敲除突变体的基因互补实验 38-39 1.6 Moswi6基因敲除转化子生长速率及孢子形态表型观察 39 1.6.1 不同培养条件下生长速率测定 39 1.6.2 Moswi6敲除突变体的产孢及孢子形态观察 39 1.7 Moswi6敲除突变体致病性测定 39-40 1.7.1 水稻叶片离体接种 39 1.7.2 水稻叶片喷雾接种 39-40 1.7.3 水稻叶鞘接种实验 40 1.7.4 洋葱表皮侵入实验 40 1.8 Moswi6敲除突变体菌丝形态观察 40 1.9 Moswi6敲除突变体对细胞壁完整性的影响 40-41 1.9.1 细胞壁胁迫因子敏感性分析 40 1.9.2 原生质体释放实验 40-41 1.9.3 Moswi6敲除突变体几丁质含量测定 41 1.9.4 几丁质合成酶表达量分析 41 1.10 Moswi6敲除突变体对漆酶的影响 41-42 1.10.1 Cu~(2+)胁迫敏感性分析 41-42 1.10.2 漆酶活性检测及含量测定 42 1.10.3 漆酶相关基因表达量分析 42 1.11 Moswi6敲除突变体对胞外过氧化物酶的影响 42-43 1.11.1 外源过氧化氢胁迫敏感性分析 42 1.11.2 胞外过氧化物酶活性检测 42 1.11.3 过氧化物酶基因表达量分析 42-43 2 结果与分析 43-62 2.1 Moswi6基因的克隆与序列分析 43 2.2 Moswi6基因的拷贝数分析 43-46 2.3 Moswi6与Mps1互作 46-47 2.4 Moswi6敲除载体的构建和突变体的获得 47-49 2.5 Moswi6敲除载体的生长表型分析 49-51 2.5.1 不同生长条件下生长速率分析 49-50 2.5.2 突变体菌丝形态观察 50-51 2.6 Moswi6敲除载体影响细胞壁完整性 51-55 2.6.1 突变体对细胞壁相关胁迫因子耐受性增强 51-53 2.6.2 突变体原生质体释放速率减慢 53 2.6.3 突变体菌株细胞壁几丁质含量升高 53-55 2.7 Moswi6敲除突变体致病力丧失 55-58 2.8 Moswi6敲除突变体漆酶活性降低 58-60 2.9 几丁质含量增加和色素减少导致菌丝形态改变 60 2.10 Moswi6敲除突变体胞外过氧化物酶活性降低 60-62 3 讨论 62-64 3.1 Moswi6敲除突变体导致致病性降低 62-63 3.2 含有APSES结构域的转录因子Moswi6影响菌丝形态 63 3.3 Moswi6是Mps1 MAPK信号通路下游的转录因子 63-64 参考文献 64-69附录1 试验常用培养基 69-71附录2 敲除载体构建及转化子验证引物序列 71-72附录3 荧光定量PCR引物序列 72-75攻读硕士学位期间发表的研究论文 75-77致谢 77

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