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二氧化硅诱导肺细胞间隙连接功能下调及其分子机制的研究

作　者: 毛国根
导　师: 姜槐
学　校: 浙江大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 二氧化硅矽肺肺纤维化肺泡巨噬细胞肺成纤维细胞肺泡上皮细胞核仁组成区间隙连接连接蛋白Cx43 磷酸化 FRAP LSCM ELISA 间接免疫荧光组织化学 western bot
分类号: R114
类　型: 博士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

间隙连接细胞间通讯（gap junctional intercellular communication，GJIC）是细胞通讯的的重要内容，通过细胞间离子和分子的共享传递生长抑制/增殖信息，发挥细胞繁殖增生和转化控制的重要调节作用。GJIC功能下调（downregulation）可引起细胞持续性增殖和转化，而改善GJIC功能可以对细胞的增殖和转化产生明显的抑制效应。 GJIC的结构单位由连接子（connexon）组成，其功能蛋白成份是连接蛋白（connexin，Cx）。视其功能在细胞膜上定位呈点状分布（punctate distribution）和/或呈斑片状、聚集分布（plaques），对GJIC功能有重要调节作用。而且有越来越多的证据证明，间隙连接蛋白Cx基因本身是肿瘤抑制基因的一大家簇。所以Cx蛋白的表达（数量）及其在细胞膜上的定位，同样与细胞增殖及细胞转化直接相关。有报道，动物和人肺组织表达Cx43，不（或低）表达Cx26或Cx32等。目前认为，Cx43是正常人肺细胞（上皮和间质细胞）间隙连接通道的主要成份。理论上，GJIC功能的抑制，可以发生在细胞粘连的缺失或细胞突变、以及Cx基因mRNA转录下调、Cx基因mRNA翻译过程或翻译后修饰异常。具体地说，肺细胞GJIC功能下调，可以在功能蛋白—Cx43基因mRNA转录、Cx43蛋白细胞膜上定位和组构、Cx43蛋白表达和磷酸化（NP、P₁、P₂、P₃）水平上进行调控。二氧化硅吸入导致矽肺的发生、发展，实质就是SiO₂作用于肺组织，引发肺间质成纤维细胞的持续性增殖和胶原大量合成。但其生化和细胞学机制尚未明确。近年来的研究热点是肺泡炎细胞群（巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞）产生的细胞因子与成纤维细胞的相互关系。目前认为，SiO₂刺激肺泡巨噬细胞（AMs）产生的细胞因子等各l 种活性物质，如 PDGF，IGFI和 FGF是肺纤维化发生的直接因素。D 但有关这方面报道结论不尽相同，主要是各细胞因于在纤维化发生的－具体效应份量，及其错综复杂的关系，目前尚难以搞清；细胞因子对D 成纤维细胞胶原合成和增殖作用机理也是不清楚的。I 本学位论文拟在上述研究和推论的基础上，研究肺成纤维细胞和l 肺泡上皮细胞 GJIC功能下调与矽肺纤维化发生的关系，及其下调机］制，包括CX43蛋白的定位的三维重建、CX43蛋白表达和CX43蛋白D 磷酸化状态，来探索矽肺纤维化及矽肺相关肺癌发生的机理。D 第一部分：二氧化晌蹦纤维化发生的体外研究细胞学模型建立D 不同剂量的a。刺激大鼠旧D拍泡巨噬细胞NMS)及佛波酯】（PMA）诱导分化 THP＊（具有肺巨噬细胞特性的人血单核细胞株）l 细胞培养上清液，分别作用于中国仓鼠肺成纤维细胞KHL)和貂肺上l 皮细胞(CCL64X 采用四哇盐(MTT广色法测定其增殖效应。其中IPMA－primed THP－1细胞为 AMs平行对照（paralleled control），以l 提高实验的重复性。结果显示，在 0，50，100，200，500 pglml SIO。l 浓度范围，5％SIOZ刺激 AMs和 10％SIOZ刺激的 PMAprimedITHP1细胞上清液分别作用于CHL和CCL64细胞，均可引起细胞l 增殖，从 200 pglml开始有显著意义，并存在剂量－效应关系。10％ SIO。刺激AMS的上清液作用CHL和CCL64细胞，则抑制细胞的 l 增殖。可以认为，5％SIOZ刺激的 AMs上清液和 10％PMA中rimed THP1细胞上清液作用于CHL和CCL书4，建立的体外细胞模型在矽肺纤维化发生和矽肺相关肺癌的研究中有应用前景。D 核仁组成区相关的嗜银蛋白（aFgyroPhilic nuclear oFganlzer regions，Ag－NOR）是具有调节细胞 rDNA转录功能的一组酸性非组蛋白，可以作为 rDNA转录活性标志，目前己广泛应用于研究细 l 胞生长活性，是反映细胞增殖的良好指标。即Ag－NOR数目与细胞的增生活跃程度有关，其含量越高，表明细胞增殖越快。AgNOR 颗粒呈两种形态，一种呈团块状，即主核仁中的Ag－NOR颗粒(以均数mAg－NOR表示，反映细胞倍体＼另一种为散在于细胞核内的较小的银染颗粒，即卫星Ag利OR(以分散度dAg利OR表示，反映细胞增殖人 SjOZ刺激的PMA个rimed THP＊细胞上清液对CHL 细胞AgNOR形态特征计数：油镜下，可见opglml剂量组以主核仁中的 AgNOR颗粒为主，卫星核仁中 Ag－NOR颗粒较少。随着 SIOZ 31l 剂量浓度的增加，mAg－NOR和dAg－NOR逐渐增多，呈?

全文目录

二氧化硅诱导肺细胞间隙连接功能下调及其分子机制的研究  1-3
缩略语  3-4
论文摘要（中文）  4-9
（英文）  9-17
第一部分二氧化硅刺激肺纤维化发生的体外研究细胞学模型建立  17-35
  一、 SiO_2刺激肺泡巨噬细胞上清液对肺成纤维细胞和肺泡上皮细胞增殖研究  18-27
  二、 SiO_2刺激肺泡巨噬细胞上清液引起早期矽结节样病  27-30
  三、 SiO_2刺激THP-1上清液对CHL细胞Ag-NOR形成及其增殖的关系研究  30-35
第二部分二氧化硅诱导肺细胞间隙连接功能下调及其机制的研究  35-74
  一、 SiO_2刺激肺成纤维细胞间隙连接功能下调的研究  36-45
  二、 SiO_2致肺成纤维细胞连接蛋白connexin 43的定位改变  45-52
  三、 SiO_2对肺成纤维细胞Cx43表达影响的研究  52-58
  四、 SiO_2刺激肺泡上皮细胞间隙连接功能下调的研究  58-63
  五、 SiO_2致肺泡上皮细胞连接蛋白connexin 43的定位改变  63-68
  六、 SiO_2致肺成纤维细胞和肺泡上皮细胞连接蛋白connexin 43磷酸化改变研究  68-74
综述：矽肺发病的细胞与分子机理Mechanisms in the Pathogenesis of Silicosis  74-93
在读期间发表的论文、负责的科研项目  93-92
志谢  92-93

二氧化硅诱导肺细胞间隙连接功能下调及其分子机制的研究

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