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PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞NF-κB信号的影响

作　者: 吕春子
导　师: 张书霞
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 猪圆环病毒Ⅱ 淋巴细胞核因子κB 磷酸化抑制性κBα 磷酸化P38
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

PCV2是断奶猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,在仔猪体内PCV2主要感染单核／巨噬细胞,并导致淋巴细胞的大量缺失,引起多种细胞因子及其相关受体的变化。本试验用PCV2作用于体外培养仔猪脾脏淋巴细胞,探讨核因子KB (NF-κB)信号途径的激活、激活机制及与细胞因子之间的关系,从而为临床上PMWS的炎症反应及其防治提供理论基础。试验一：5头经ELISA检测PCV2抗体阴性的35日龄断奶仔猪,无菌采集脾脏,分离脾脏细胞,分为对照组和攻毒组进行体外培养。攻毒组接种PCV2,并分别于培养后0 h、6 h、12 h、24 h收取淋巴细胞。用激光共聚焦法定性检测NF-KB/P65的核易位,并分别提取细胞核蛋白和胞浆蛋白,Western-Blot定量检测细胞核中NF-KB/P65和细胞浆中P-IκBα、p-P38的蛋白含量的变化,电泳迁移率(EMSA)法检测细胞核是NF-κB与DNA的结合率。定性结果表明,对照组仔猪淋巴细胞在培养后0h、6h、12h未见NF-κB/P65的核易位,培养24 h的淋巴细胞核内能见到NF-KB/P65;而PCV2接种后6h的淋巴细胞核内就能明显见到NF-KB/P65蛋白,并随着攻毒时间的延长,NF-KB/P65的核易位逐渐增多。定量结果,培养后Oh、6h、12h的对照组淋巴细胞核内,未检测到NF-KB/P65蛋白和NF-κB与DNA的结合,细胞浆内也未能检测到p-IκBa和p-P38蛋白,只有24 h的对照组淋巴细胞中才能检测到各种蛋白。试验组仔猪淋巴细胞,PCV2接种后6h就能明显检测到NF-κB/P65蛋白的核易位,并随着PCV2作用时间延长NF-κB/P65蛋白的核易位逐渐增多,到接种PCV2后24h显著高于其对照组(P<0.05)；试验组仔猪淋巴细胞中p-IκBa蛋白含量和NF-κB与DNA的结合率也均随攻毒时间增加而逐渐升高,到攻毒后24h均显著高于对照组(P<0.05)；统计学分析显示,淋巴细胞核中NF-κB/P65与细胞浆中p-IκBα含量呈显著正相关,相关系数达0.909(P=0.000)；试验组仔猪淋巴细胞中p-P38蛋白含量,在攻毒6 h、12 h和24 h均能检测到,但与对照组相比变化不显著(P>0.05)。用我们实验室曾测定的PCV2对体外培养脾脏细胞分泌细胞因子影响的结果与NF-κB进行相关性分析显示,NF-κB/P65蛋白的核易位与TNF-α、IL-6RmRNA和IL-10RmRNA具有显著的正相关,其相关系数分别达到0.757(P=0.002)、0.783(P=0.000)和0.764(P=0.000)；而NF-κB和IL-6、IL-6mRNA、IL-10和IL-10mRNA之间相关性不明显,这可能是非同批次实验造成的,但从一个侧面说明了PCV2可以通过NF-κB信号调节某些细胞因子的转录和表达。以上结果表明,PCV2可通过IκBα的磷酸化途径激活NF-κB,使其发生核易位,并与DNA结合,从而有效调控各种炎性细胞因子的转录和表达。而P38MAPK信号在PCV2调节炎性细胞因子表达过程中的作用不明显。试验二：5头经ELISA检测PCV2抗体阴性的35日龄断奶仔猪,无菌采集脾脏,分离脾脏淋巴细胞进行体外培养,并于培养后0h、12h和18h接种PCV2,24 h后统一收取淋巴细胞。Western-Blot检测NF-κB/P65、p-IκBα、p-P38的蛋白含量的变化,EMSA检测NF-κB与DNA的结合率。结果显示,NF-κB/P65蛋白的表达随PCV2作用时间增加逐渐升高,PCV2作用24 h较Oh和6h极显著升高(P<0.01),较12h显著升高(P<0.05)；NF-κB与DNA的结合率也随PCV2作用时间延长逐渐升高,24h时极显著高于0h和6h(P<0.01),较12h显著升高；p-IκBα蛋白的含量,在PCV2作用24h时达到最高,并且极显著高于Oh、6h和12h(P<0.01),除6h组和12h组之间无显著差异(P>0.05)外,其余组之间两两差异均显著；p-P38蛋白含量,在PCV2作用6h时有所下降,12h和24h上升,并在24h显著高于6h(P<0.05),其余组之间变化均不显著(P>0.05)。结果表明,PCV2能通过激活仔猪淋巴细胞中NF-κB信号,从而对相关炎性细胞因子进行调控。

全文目录

摘要 7-9ABSTRACT 9-11部分缩写的中英文对照 11-12第一篇文献综述 12-25 第一章 PCV2与P38、NF-κB信号通路 13-25 1 猪圆环病毒 13-16 1.1 PCV的病原特点 13 1.2 PCV2的流行病学及其引起的相关疾病 13-14 1.3 PMWS的基本情况 14 1.4 PCV2感染对淋巴细胞的影响 14-15 1.5 PCV2对细胞因子的影响 15-16 2 全身炎症反应综合征 16-17 2.1 全身炎症反应综合征概述 16 2.2 SIRS与细胞凋亡 16-17 3 NF-κB信号转导通路 17-21 3.1 NF-κB和IκB的家族成员 17-18 3.2 NF-κB的信号转导通路 18-19 3.3 NF-κB信号调节途径 19-20 3.4 NF-κB对细胞因子的调节 20-21 4 P38MAPK信号转导通路 21-23 4.1 P38MAPK的结构特征及家族成员 21-22 4.2 P38MAPK的信号调节 22 4.3 P38MAPK对炎性因子的调节 22-23 5 P38-NF-κB对于微生物感染的调控 23-24 6 实验目的与意义 24-25第二篇试验研究 25-57 第二章 PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞NF-κB信号的影响 27-49 1 材料与方法 29-36 1.1 病毒 29 1.2 主要试剂和仪器 29-31 1.3 实验动物及处理 31 1.4 激光共聚焦检测NF-κB/P65的核易位 31-32 1.5 Western blot法检测NF-κB/P65、p-IκBα的蛋白表达 32-34 1.6 EMSA检测NF-κB/P65的迁移率 34-36 1.7 数据处理及统计 36 2 结果 36-45 2.1 PCV2对体外培养淋巴细胞NF-κB信号的影响 36-42 2.2 PCV2对体外培养仔猪脾脏淋巴细胞p-P38蛋白含量的影响 42-44 2.3 NF-κB与p-IκBα、各细胞因子及其受体之间的相关性分析 44-45 3 讨论 45-49 3.1 PCV2能明显激活NF-κB信号 45 3.2 PCV2通过IκBα的磷酸化降解而激活NF-κB信号 45-46 3.3 PCV2能通过NF-κB途径调控某些细胞因子的表达 46-47 3.4 PCV2与P38MAPK途径之间无明显联系 47-49 第三章相同培养时间下PCV2对仔猪淋巴细胞NF-κB信号的动态影响 49-57 1 材料与方法 50-51 1.1 病毒 50 1.2 主要试剂和仪器 50 1.3 实验动物及处理 50 1.4 Western blot法检测NF-κBP65、p-IκBα和p-P38的蛋白表达 50 1.5 EMSA检测NF-κB与DNA结合率 50 1.6 数据处理及统计 50-51 2 结果与分析 51-54 2.1 PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞核蛋白中NF-κB/P65蛋白含量的影响 51-52 2.2 PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞核中NF-κB DNA结合率的影响 52-53 2.3 PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞p-IκBα蛋白含量的影响 53 2.4 PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞p-P38蛋白含量的影响 53-54 3 讨论 54-57 3.1 PCV2能够显著激活NF-κB的信号 54-55 3.2 PCV2对P38MAPK信号的影响 55-57参考文献 57-65全文总结 65-67致谢 67

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