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银杏GbPAL和GbANS基因的克隆与表达及ALA对类黄酮含量的影响

作　者: 许锋
导　师: 程述汉；程水源；束怀瑞
学　校: 山东农业大学
专　业: 果树学
关键词: 银杏 类黄酮 苯丙氨酸解氨酶 花青素合成酶 基因克隆 表达 5-氨基乙酰丙酸
分类号: S567.19
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


银杏叶类黄酮具有重要的药用价值,提高其含量已成为银杏研究的热点与难题。研究表明,采用生理生化途径调控银杏叶类黄酮含量是一种有效的方法;利用植物基因工程技术提高银杏叶类黄酮含量也具有良好的前景。然而,银杏类黄酮生物合成途径在分子水平上的报道还较少。为深入研究银杏类黄酮的合成途径,并为今后利用基因工程技术提高银杏类黄酮含量奠定基础,本文首次克隆并研究了银杏类黄酮合成途径中的两个重要的基因,它们分别是苯丙氨酸解氨酶基因(GbPAL)和花色素合成酶基因(GbANS)。针对生理生化途径,本文研究了5-氨基乙酰丙酸(ALA)处理对银杏叶片类黄酮含量影响,以期为提高银杏叶类黄酮含量提供理论依据。其主要研究内容与结果如下:(1)银杏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、性质以及表达模式研究。利用RACE技术从银杏中克隆获得一个苯丙氨酸解氨酶基因GbPAL的cDNA和基因组全长(GenBank Accession No. EU071050)。GbPAL基因基因组序列与cDNA序列一样,无内含子。GbPAL基因cDNA全长为2886 bp,含有一个2172 bp的开放阅读框(ORF),编码724个氨基酸。蛋白质同源比对分析表明,GbPAL与其它植物的PAL蛋白高度同源,且包含苯丙氨酸解氨酶所必需的保守氨基酸位点和保守模式。用同源建模的方法得到GbPAL蛋白的三维模型,这个模型与欧芹PAL(PcPAL)的三维结构高度相似。PAL基因的系统进化树分析结果表明,GbPAL与裸子植物的PAL具有更近的亲缘关系。Southern blot结果表明,GbPAL基因属于一个多基因家族。实时定量PCR(real-time PCR)分析表明,GbPAL基因在银杏不同器官中组成型表达,但在茎和叶中的表达相对较高。Real-time PCR分析结果显示,GbPAL基因的表达受UV-B、机械损伤、水杨酸和低温的诱导,暗示GbPAL基因参与了银杏对逆境胁迫的抗性。线性回归分析结果表明银杏叶类黄酮含量与GbPAL基因表达量之间存在显著正相关关系,表明GbPAL基因可能是银杏叶类黄酮合成途径中的关键基因之一。(2)银杏花色素合成酶基因的克隆、功能分析及响应非生物胁迫的表达模式。利用RACE技术首次从裸子植物银杏中克隆得到一个花色素合成酶基因GbANS的cDNA全长(EU600206)和基因组序列(EU600205)。GbANS基因全长cDNA为1441 bp,含有一个1062 bp的ORF,编码354个氨基酸。蛋白序列多重比对结果表明,GbANS蛋白与其它植物的ANS蛋白具有很高的相似性,GbANS存在结合亚铁离子和酮戊二酸的保守位点。GbANS基因含有三个外显子和两个内含子。通过基因组步移的方法获得了GbANS基因的5’侧翼序列,该区域含有包括TATA盒在内的启动子必需元件,序列预测表明,这个区域还含有光、冷、水杨酸、乙烯和脱落酸应答等顺式作用元件。同源建模产生的GbANS三维结构与功能已知的、拟南芥ANS(AtANS)的三维结构一样,具有2-ODD酶特征性的扭曲果冻状结构。类黄酮特异2-ODD酶进化树分析表明,GbANS与其它植物的ANS具有共同的祖先。Southern blot结果显示,GbANS基因属于一个多基因家族。Real-time PCR分析表明,GbANS基因的表达水平在不同器官以及器官不同时期均有差异性,在成熟果中的表达量最高,胚珠和雄蕊,茎和根中未检测到有表达,花青苷在各器官中的含量显示了与GbANS基因器官与发育表达图谱良好的一致性。real-time PCR分析结果显示GbANS基因的表达水平受UV-B、脱落酸、低温、水杨酸、乙烯以及蔗糖上调,这一结果与GbANS基因启动子序列预测分析的结果相吻合,表明GbANS基因可能参与银杏对上述逆境胁迫下的抗性。原核表达的重组GbANS蛋白的分子量大小和通过生物信息学预测的分子量大小相同。Western blot试验结果表明,重组GbANS蛋白的N末端含有6×His标签,说明GbANS基因编码的GbANS蛋白可以在大肠杆菌中正确的表达。利用HPLC分析纯化的重组GbANS蛋白体外酶活性,结果表明重组GbANS蛋白具有两种功能,即(1)催化无色花青素生成花青素,(2)催化二氢槲皮素生成槲皮素。(3) ALA对银杏类黄酮含量的影响。以3年生盆栽银杏实生苗为试材,研究了叶面处理浓度分别为10、100 mg/L的ALA对银杏叶光合作用、叶绿素含量、可溶性糖含量、类黄酮含量、总多酚含量、花青苷、黄酮合成相关的酶(PAL、CHS和CHI)活性的影响。结果表明,在处理后的第4天,相对对照而言,ALA处理的银杏叶的光合速率显著提高,ALA的这种促进作用一直稳定维持到处理后的第16天。ALA处理能显著提高银杏叶的叶绿体和可溶性糖含量,且随着处理时间的延长增幅加大,但对于叶绿体a/叶绿体b的比值无显著性差异。总酚、类黄酮以及花青苷含量在ALA的处理下迅速增加,其增加速率显著高于对照。ALA处理下PAL、CHS和CHI的活性变化与类黄酮含量的变化趋势相似,表明ALA可显著诱导PAL、CHS和CHI的活性。上述处理效果均具有浓度效应,以100mg/L ALA的效果较佳。

全文目录


中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
第一章 前言  13-27
  1 课题的提出  13-14
  2 银杏叶类黄酮研究进展  14-26
    2.1 银杏叶类黄酮的合成  14-18
    2.2 调节银杏叶类黄酮合成代谢的因子  18-20
    2.3 银杏叶类黄酮合成代谢的遗传和生理生化机理  20-26
  3 本课题研究的内容、目的及意义  26-27
第二章 银杏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、性质以及表达模式研究  27-56
  1 材料与方法  28-36
    1.1 试验材料  28-29
    1.2 方法  29-36
  2 结果与分析  36-49
    2.1 GbPAL 的全长cDNA 序列的克隆和特征分析  36-39
    2.2 GbPAL 的基因组序列的克隆及其特征分析  39
    2.3 GbPAL 蛋白质的特征分析  39-41
    2.4 GbPAL 蛋白的三维模型分析  41-44
    2.5 GbPAL 基因的系统进化树分析  44-45
    2.6 GbPAL 基因的Southern blot 分析  45-46
    2.7 GbPAL 基因的表达分析  46-49
    2.8 银杏叶生长过程中类黄酮积累以及PAL 活性、GbPAL 基因表达水平之间的关系  49
  3 讨论  49-55
    3.1 GbPAL 基因的克隆及性质分析  49-52
    3.2 GbPAL 基因的表达模式  52-54
    3.3 GbPAL 基因表达量与黄酮的积累  54-55
  4 小结  55-56
第三章 银杏花色素合成酶基因的克隆、功能分析以及响应非生物胁迫的表达模式  56-90
  1 材料与方法  57-67
    1.1 试验材料  57-59
    1.2 方法  59-67
  2 结果与分析  67-85
    2.1 GbANS 基因全长cDNA 的克隆及其特征分析  67-69
    2.2 GbANS 的基因组序列的克隆及其特征分析  69-70
    2.3 GbANS 的基因5'侧翼序列分析  70-71
    2.4 GbANS 蛋白质的特征分析  71-74
    2.5 GbANS 蛋白质的三维模型分析  74-76
    2.6 GbANS 基因的系统进化树分析  76-77
    2.7 GbANS 基因的Southern blot 分析  77
    2.8 GbANS 基因的组织特异性表达及对应器官的花青苷含量分析  77-79
    2.9 GbANS 基因在紫外、低温、水杨酸、脱落酸、乙烯利和蔗糖处理下的表达模式  79
    2.10 GbANS 重组蛋白的原核表达、纯化及Western blot 分析  79-82
    2.11 GbANS 重组蛋白体外酶活性分析  82-85
  3 讨论  85-88
    3.1 GbANS 基因克隆及性质  85-86
    3.2 GbANS 基因的组织特异性表达模式  86
    3.3 GbANS 基因的响应逆境胁迫的表达模式  86-88
    3.4 GbANS 重组蛋白的功能分析  88
  4 小结  88-90
第四章 5-氨基乙酰丙酸对银杏叶类黄酮含量的影响  90-103
  1 材料与方法  90-93
    1.1 试验材料及处理  90-91
    1.2 测定方法  91-92
    1.3 数据分析  92-93
  2 结果与分析  93-99
    2.1 ALA 对银杏叶光合速率的影响  93
    2.2 ALA 对银杏叶绿体含量的影响  93-94
    2.3 ALA 对银杏叶可溶性糖含量的影响  94-95
    2.4 ALA 对银杏叶总酚、类黄酮和花青苷积累的影响  95-97
    2.5 ALA 对银杏叶PAL、CHS 和CHI 活性的影响  97-99
  3 讨论  99-101
    3.1 ALA 对银杏叶片光合速率和叶绿体含量的影响  99
    3.2 ALA 对银杏叶可溶性糖含量的影响  99-100
    3.3 ALA 提高银杏叶总酚、类黄酮和花青苷含量生理机制  100-101
  4 小结  101-103
第五章 结论及创新点  103-105
  1 GBPAL 基因的克隆与表达分析  103
  2 GBANS 基因的克隆、表达与功能分析  103
  3 ALA 对银杏叶类黄酮含量的影响  103-104
  4 下一步研究设想  104
  5 本文创新点  104-105
参考文献  105-118
博士期间发表和整理论文情况  118-119
致谢  119

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