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GLI3基因与单纯性马蹄内翻足的相关性研究及其作用机制探讨

作　者: 曹东华
导　师: 金春莲
学　校: 中国医科大学
专　业: 遗传学
关键词: 单纯性马蹄内翻足 GLI3 HOXD13 表达调控
分类号: R726.8
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

GLI3基因与单纯性马蹄内翻足的相关性研究及其作用机制探讨前言单纯性马蹄内翻足(Idiopathic congenital talipes equinovarus, ICTEV)是常见的严重危害儿童健康的先天畸形之一,发病率为1～8‰。遗传因素在ICTEV的发病过程中发挥重要作用,遗传度为65%。但其遗传方式、外显率等均不清楚,易感基因尚未确定。目前研究较多的与ICTEV发病相关的基因主要集中在与足踝部的骨骼、软骨、肌肉和神经发育相关的基因,如COL9A1, CASP10, WNT7A, HOXD13,GLI3等。本课题组前期应用SNP关联分析的方法对84个ICTEV核心家系GLI3基因内的2个多态位点进行分析,提示CLI3基因可能是单纯性马蹄内翻足的易感基因。GLI基因家族是一个高度保守的转录因子家族,其中的GLI3是极化活性区内的信号分子之一,它可以沿肢体前后轴方向限定各个基因表达的区域边界,这为建立肢体不对称模式提供了必要的位置信息。国内外学者对GLI3基因的研究主要集中于它与指(趾)的发育畸形相关,其突变可以导致多种与指(趾)畸形相关的疾病,但CLI3基因是否与ICTEV的发病相关还未见报道。另有报道HOXD13基因与ICTEV的发生密切相关,本实验进一步探讨GLI3基因与ICTEV的相关性,以及在ICTEV发生过程中HOXD13基因如何调控CLI3基因的机制。方法标本：84例ICTEV患者外周静脉血和15例ICTEV患者肌肉组织标本由中国医科大学附属盛京医院小儿外科提供,9例同年龄组的正常人足部肌肉组织及肺组织由中国医科大学法医学院提供。所有标本使用均经患者知情同意。成年Wistar大鼠购自中国医科大学实验动物中心,所有的实验过程都遵照动物保护条例。1、变性梯度凝胶电泳技术检测GLI3基因编码区的突变PCR扩增84例患者GLI3基因10个外显子(另外4个外显子基因突变筛查工作前期已经完成),应用20%～80%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳筛查10个外显子的突变情况。2、RT-PCR方法研究GLI3基因在ICTEV患者下肢表达情况。分别提取ICTEV患者及正常人下肢足踝部拇长屈肌、正常人肺组织的总RNA,应用RT-PCR方法检测GLI3基因的表达。3、构建ICTEV大鼠模型Wistar大鼠于孕10天全反式维甲酸灌胃给药(剂量：135mg/kg体重)。4、Real Time PCR,免疫组织化学染色和Western Blotting方法研究Gli3基因在ICTEV模型鼠下肢肌肉组织中的表达分别提取ICTEV模型胎鼠及正常对照胎鼠下肢肌肉组织的总RNA,应用Real Time PCR检测Gli3基因的表达情况；分别提取ICTEV模型胎鼠及正常对照胎鼠下肢肌肉组织的蛋白质,应用Western Blotting检测Gli3蛋白的表达情况；分别取ICTEV模型胎鼠及正常对照胎鼠下肢,甲醛固定,石蜡包埋,按照免疫组化试剂盒操作说明检测Gli3蛋白表达情况。5、应用P-Match软件预测大鼠Gli3基因5′上游序列转录因子的结合位点获取大鼠Gli3基因上游1100bp 5′侧翼序列信息(http://www.ensembl.org),应用P-Match软件预测其转录因子结合位点。6、荧光素酶报告基因系统PCR扩增大鼠Gli3基因启动子区域依次截短的启动子序列,构建荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Gli3。瞬时转染大鼠L6细胞,观察大鼠Gli3基因启动子区域活性。7、染色质免疫沉淀实验(ChIP)将孕14天胎鼠下肢肢芽直接匀浆处理,甲醛交联、酶切后应用Gli3抗体进行沉淀,沉淀下来DNA通过PCR扩增检测结果。8、凝胶迁移实验(EMSA)孕14天胎鼠下肢肢芽组织核蛋白和3′生物素标记的探针(含有位点2)在凝胶阻滞缓冲液中室温结合1小时,10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜、紫外交联后,应用化学发光检测系统检测结果。9、RNAi使Hoxdl3基因表达下调,观察Gli3基因的表达情况化学合成Hoxdl3基因的siRNA,转染大鼠L6细胞后,通过Real Time PCR的方法观察Gli3基因表达水平的改变。10、在大鼠L6细胞系中外源表达Hoxdl3后观察Gli3基因表达构建Hoxdl3的真核细胞表达载体PIRES2-EGFP-Hoxdl3,瞬时转染大鼠L6细胞后,通过Real Time PCR的方法观察Gli3基因表达水平的改变。结果1、在84例ICTEV患者外周静脉血中未发现GLI3基因外显子1～8、外显子13存在突变。2、在ICTEV患者及正常人下肢拇长屈肌中都未检测到GLI3基因的表达。3、不论在mRNA水平,还是在蛋白质水平,Gli3基因在ICTEV模型胎鼠下肢组织中的表达都要明显高于正常对照胎鼠。4、大鼠Gli3基因5′侧翼序列启动子区域存在不同的调控因子,利用P-Match软件预测后发现2个Hoxd13的可能结合位点,分别命名为Hoxdl3结合位点1(-667～-663)和Hoxd13结合位点2(-477～-473)。5、在大鼠胚胎肢体发育过程中Hoxd13可以和Gli3基因启动子区Hoxd13结合位点2直接结合。应用染色质免疫沉淀技术验证在体内Hoxdl3和Gli3基因上游序列的结合作用。以孕14天的大鼠胎鼠下肢肢芽组织为研究材料进行了染色质免疫沉淀实验,实验证实反胶联后提取的DNA上仅有Hoxdl3结合位点2的扩增,无Hoxdl3结合位点1的扩增。实验结果表明在大鼠胚胎肢体发育过程中Hoxdl3蛋白可以和Gli3启动子区的Hoxdl3结合位点2结合发挥其转录调节作用。6、在体外Hoxdl3蛋白可以和Gli3基因启动子区位点2直接结合。EMSA结果表明,当Hoxdl3蛋白质存在时出现阻滞的DNA-蛋白质复合体,当加入Hoxdl3抗体时出现超阻滞条带。证明在体外Hoxdl3和预测的Hoxdl3结合位点2可以直接结合。7、RNAi方法干扰HoxD13基因表达后,Gli3基因表达情况。将吉玛公司设计的三个Hoxdl3基因的siRNA瞬时转染大鼠L6细胞系中,发现其中一个siRNA能使Hoxdl3表达下调,同时检测到该标本中Gli3基因表达明显上调,说明Hoxdl3很可能是Gli3基因的负调控因子。8、大鼠L6细胞系中外源过量表达Hoxdl3后Gli3基因的表达情况。将Hoxdl3的真核细胞表达载体Hoxdl3瞬时转染大鼠L6细胞后,通过Real Time PCR的方法观察到Hoxdl3基因的表达水平明显上调,同时Gli3基因表达水平下调。结论1、GLI3基因的编码区突变可能不是ICTEV发病的原因。2、HOXDl3基因的表达下调并导致GLI3基因的表达上调可能与ICTEV畸形的发生有关。3、在大鼠胚胎肢体发育过程中Hoxdl3蛋白结合于Gli3基因启动子区域的Hoxdl3结合位点2上,并调控Gli3基因的表达。

全文目录

一、论文摘要  4-13
  中文论著摘要  4-8
  英文论著摘要  8-13
二、英文缩略语  13-14
三、论文  14-60
  论文一:GLI3基因与单纯性马蹄内翻足的相关性研究  14-34
    前言  14-15
    实验材料和方法  15-26
    实验结果  26-31
    讨论  31-33
    结论  33-34
  论文二:GLI3基因在单纯性马蹄内翻足发生中调控机制研究  34-60
    前言  34-35
    实验材料和方法  35-46
    实验结果  46-57
    讨论  57-60
四、结论  60-61
五、本研究创新性的自我评价  61-62
六、参考文献  62-65
七、论文附录  65-77
  综述  65-75
  在学期间科研成绩  75-76
  致谢  76-77
  个人简介  77

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