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在大肠杆菌内引入MVA途径高效合成抗疟药青蒿素前体—紫穗槐-4，11-二烯

作　者: 吴涛
导　师: 陈必链；方宏清
学　校: 福建师范大学
专　业: 发酵工程
关键词: 生物合成 代谢调控 甲羟戊酸途径 类异戊二烯 青蒿素 紫穗槐-4，11-二烯
分类号: TQ463
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


以青蒿素为基础的联合药物疗法(ACTs)被认为是目前治疗恶性疟疾的最有效方法。然而青蒿素供应不足且价格昂贵,限制了ACTs的广泛使用。本研究旨在采用基因工程手段构建异源类异戊二烯生物合成途径,利用大肠杆菌发酵高效合成抗疟药青蒿素前体——紫穗槐-4,11-二烯。首先在Escherichia coli DHGT7中引入人工合成的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因,利用大肠杆菌内源的法尼基焦磷酸(FPP),成功获得了紫穗槐-4,11-二烯。为提高前体供给,引入粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的甲羟戊酸(MVA)途径,紫穗槐-4,11-二烯产量提高了13.3倍,达到151 mg/L。进一步研究发现了3个限速酶,分别是紫穗槐-4,11-二烯合酶、HMG-COA还原酶和甲羟戊酸激酶；通过调节这些酶的水平,紫穗槐-4,11-二烯产量提高了7.2倍,摇瓶培养达到235 mg/L,为高效生物合成抗疟药青蒿素前体——紫穗槐-4,11-二烯奠定了基础。另外,本研究建立了薄层色谱法(TLC)快速半定量检测甲羟戊酸含量,并建立了气相色谱与质谱联用法(GC-MS)定量检测甲羟戊酸和紫穗槐-4,11-二烯含量,为代谢产物含量测定和代谢途径调控提供了技术支持。

全文目录


中文摘要  2-3Abstract  3-4中文文摘  4-7目录  7-11绪论  11-21第一章 在大肠杆菌内引入ADS产紫穗槐-4,11-二烯  21-35  1.1 前言  21-22  1.2 实验材料与方法  22-29    1.2.1 实验材料  22-25      1.2.1.1 菌株  22      1.2.1.2 培养基  22      1.2.1.3 工具酶  22-23      1.2.1.4 标准品  23      1.2.1.5 试剂盒  23      1.2.1.6 化学试剂  23      1.2.1.7 相关溶液  23-24      1.2.1.8 主要仪器设备  24-25    1.2.2 实验方法  25-29      1.2.2.1 全基因合成ADS  25      1.2.2.2 质粒pET28-ADS的构建  25-28      1.2.2.3 化学感受态细胞的制备与化学转化  28      1.2.2.4 目的基因的表达  28      1.2.2.5 紫穗槐-4,11-二烯生产菌的摇瓶培养  28-29      1.2.2.6 紫穗槐-4,11-二烯的检测方法  29  1.3 实验结果与分析  29-33    1.3.1 质粒pET28-ADS的构建  29-31      1.3.1.1 质粒pET28-ADS图谱  29-30      1.3.1.2 转化子pET28-ADS/DH5α的菌落PCR鉴定  30      1.3.1.3 质粒pET28-ADS的酶切鉴定  30-31      1.3.1.4 质粒pET28-ADS的基因测序鉴定  31    1.3.2 表达ADS产紫穗槐-4,11-二烯  31-33      1.3.2.1 诱导表达ADS  31      1.3.2.2 菌株pET28-ADS/DHGT7产紫穗槐-4,11-二烯  31-33  1.4 本章小结  33-35第二章 引入MVA途径提高紫穗槐-4,11-二烯产量  35-55  2.1 前言  35  2.2 实验材料与方法  35-41    2.2.1 实验材料  35    2.2.2 实验方法  35-41      2.2.2.1 E.faecalis基因组的提取  35      2.2.2.2 目的基因的获得  35-36      2.2.2.3 质粒pET3-ES的构建  36-37      2.2.2.4 质粒pET3FL-MD的构建  37-38      2.2.2.5 质粒pAOC3-ES-MD的构建  38-39      2.2.2.6 质粒pET28-ispA-ADS的构建  39-40      2.2.2.7 甲羟戊酸生产菌的摇瓶培养  40      2.2.2.8 甲羟戊酸的检测方法  40-41  2.3 实验结果与分析  41-52    2.3.1 质粒pET3-ES的构建  41-43      2.3.1.1 质粒pET3-E、pET22-S和pET3-ES图谱  41      2.3.1.2 转化子的菌落PCR鉴定  41-42      2.3.1.3 质粒pET3-E和pET22-S的鉴定  42-43      2.3.1.4 质粒pET3-ES的酶切鉴定  43    2.3.2 表达ES产甲羟戊酸  43-46      2.3.2.1 诱导表达mvaE和mvaS  43      2.3.2.2 菌株pET3-ES/DHGT7产甲羟戊酸  43-46    2.3.3 质粒pET3FL-MD的构建  46-47      2.3.3.1 质粒pET3FL和pET3-MD图谱  46-47      2.3.3.2 质粒pET3L和pET3FL的基因测序鉴定  47      2.3.3.3 转化子pET3FL-MD/HST04的菌落PCR鉴定  47      2.3.3.4 质粒pET3FL-MD的酶切鉴定  47      2.3.3.5 质粒pET3FL-MD的基因测序鉴定  47    2.3.4 质粒pAOC3-ES-MD的构建  47-49      2.3.4.1 质粒pAOC3ANL、pAOC3-ES和pAOC3-ES-MD图谱  47-48      2.3.4.2 质粒pAOC3ANL的基因测序鉴定  48      2.3.4.3 转化子的菌落PCR鉴定  48-49      2.3.4.4 质粒pAOC3-ES和pAOC3-ES-MD的酶切鉴定  49    2.3.5 质粒pET28-ispA-ADS的构建  49-52      2.3.5.1 质粒pET28-ispA-ADS等图谱  49-50      2.3.5.2 质粒pET3AL的基因测序鉴定  50      2.3.5.3 转化子的菌落PCR鉴定  50-51      2.3.5.4 质粒pET3AL-ispA的鉴定  51      2.3.5.5 质粒pET3AL-ispA-ADS和pET28-ispA-ADS的酶切鉴定  51-52    2.3.6 贯通整个异源紫穗槐-4,11-二烯合成途径  52  2.4 本章小结  52-55第三章 优化异源紫穗槐-4,11-二烯合成途径  55-65  3.1 前言  55  3.2 实验材料与方法  55-56    3.2.1 实验材料  55    3.2.2 实验方法  55-56      3.2.2.1 质粒pAOC3-ES-MD-ispA-ADS的构建  55-56      3.2.2.2 质粒pET28-E-ADS的构建  56      3.2.2.3 质粒pET28-E-MK-ADS的构建  56  3.3 实验结果与分析  56-63    3.3.1 质粒pAOC3-ES-MD-ispA-ADS的构建  56-58      3.3.1.1 质粒pAOC3-ES-MD-ispA-ADS图谱  56-57      3.3.1.2 转化子pAOC3-ES-MD-ispA-ADS/DHG5α菌落PCR鉴定  57      3.3.1.3 质粒pAOC3-ES-MD-ispA-ADS的酶切鉴定  57-58    3.3.2 质粒pET28-E-ADS的构建  58-59      3.3.2.1 质粒pET3-E-ADS和pET28-E-ADS图谱  58      3.3.2.2 转化子的菌落PCR鉴定  58-59      3.3.2.3 质粒pET3-E-ADS和pET28-E-ADS的酶切鉴定  59    3.3.3 质粒pET28-E-MK-ADS的构建  59-61      3.3.3.1 质粒pET3FL-MK和pET28-E-MK-ADS图谱  59-60      3.3.3.2 转化子的菌落PCR鉴定  60-61      3.3.3.3 质粒pET3FL-MK的鉴定  61      3.3.3.4 质粒pET28-E-MK-ADS的酶切鉴定  61    3.3.4 优化紫穗槐-4,11-二烯合成途径  61-63    3.3.5 不同宿主产紫穗槐-4,11-二烯  63  3.4 本章小结  63-65第四章 结论  65-67附录1  67-69附录2  69-71附录3  71-73参考文献  73-79攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  79-81致谢  81-83个人简历  83-85

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 制药化学工业 > 有机化合物药物的生产
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