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AKR1B10在结肠癌和肺癌细胞生长中的作用及机制

作　者: 王春
导　师: 廖端芳；曹德良
学　校: 中南大学
专　业: 药理学
关键词: 醛酮还原酶家族1成员B10 乙酰辅酶A羧化酶α DNA损伤凋亡肺癌
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

醛酮还原酶家族1成员B10 (AKR1B10,也叫醛糖还原酶相似蛋白1,ARL-1)主要在正常人结肠和小肠表达,而在肝癌和肺癌中过度表达。AKR1B10能将有毒的醛酮类物质还原成相应的醇,具有解毒功能。并且AKR1B10还能通过与乙酰辅酶A羧化酶α(ACCA)形成蛋白复合物,阻止ACCA降解,从而调节脂质合成。ACCA在许多人类肿瘤中表达上调,它可能通过刺激脂质合成促进癌细胞的生长和增殖。AKR1B10在消化道的生物学作用,以及在肿瘤发展、进展中的作用还不清楚。本研究从分子生物学角度,初步探讨了AKR1B10对结肠癌细胞(HCT-8)和非小细胞型肺癌细胞(NCI-H460)的作用及相关机制。然后以非小细胞型肺癌细胞(NCI-H460和A549)为重点,通过体内、体外实验相结合,进一步研究了AKR1B10对非小细胞型肺癌生长的促进作用及分子机制。这些研究为AKR1B10作为肿瘤的防治靶点提供理论依据。由于AKR1B10调节ACCA的活性,在本研究中,我们首先检测了ACCA在结肠癌细胞(HCT-8和HCT-15)和非小细胞型肺癌细胞(NCI-H460)中的表达,以及应用ACCA抑制剂(TOFA)和小干扰RNA (siRNA),观察了ACCA在这些细胞生长存活中的作用。结果表明TOFA有显著的细胞毒性作用,对NCI-H460、HCT-8和HCT-15细胞的半数抑制剂量分别是5.0、5.0和4.5μg/ml。TOFA在1.0-20.0μg/ml时,呈剂量依赖性地有效地抑制了脂肪酸合成,诱导细胞凋亡。通过检测PARP分裂、DNA断裂和annexin-V染色这些凋亡指标评估了细胞死亡。TOFA处理和siRNA转染都同样地诱导了细胞凋亡。补充细胞100μM棕榈酸,脂肪酸合成末端产物,有效地阻止了TOFA和：siRNA诱导的凋亡。接着,我们研究了AKR1B10沉默对细胞生长和存活的作用。结果在HCT-8和NCI-H460细胞中,小干扰RNA介导的AKR1B10表达下调导致了caspase-3介导的凋亡。在这些细胞中,总的和亚类细胞脂质,尤其是磷脂减少了50%多,伴随反应性氧化物质(ROS)增加了2到3倍,线粒体细胞色素C流出和caspase-3断裂。AKR1B10沉默也增加了α,β-未饱和醛酮物,导致细胞脂质过氧化物增加2到3倍。补充细胞80μM棕榈酸(脂肪酸合成的末端产物)后,部分地阻断了AKR1B10沉默诱导的凋亡。而AKR1B10抑制剂epalrestat也使细胞内脂质过氧化物升高2倍多,并导致细胞凋亡。这些结果表明AKR1B10通过调节脂质代谢和消除细胞醛酮类物质影响细胞存活。对肺癌的研究被扩展到评估AKR1B10作为肺癌防治靶点的潜力,我们使用siRNA使AKRIBIO表达下调,评估了非小细胞型肺癌细胞和肿瘤的生长。结果表明在NCI-H460和A549细胞中,AKR1B10沉默阻止了细胞生长,并且减少了细胞液体培养基中和半固体培养基中的克隆形成率达40%多。组蛋白H2AX的磷酸化(DNA损伤的一个标志)和彗星实验(alkaline comet assays)结果表明在AKR1B10沉默的细胞中,DNA损伤几乎是对照组细胞的3倍。增加的基因毒性应激也导致了p53活化和抗凋亡蛋白bcl-2表达减少,即Bax/bcl-2的比率增加,同时也激活了caspase-3介导的PARP (poly(ADP-ribose) polymerase)断裂和细胞凋亡。更重要的是,在裸鼠肿瘤移植实验中,AKR1B10表达下降明显地延迟了皮下肺移植肿瘤的形成和进展。在NCI-H460肺癌动物模型中,当AKR1B10的表达被沉默后,肿瘤直到细胞注射后第17天才慢慢出现,而对照组裸鼠的肿瘤在第9天就开始出现；并且对照组裸鼠肿瘤的生长速度将近是AKR1B10沉默组的2倍。同时,在A549细胞的肿瘤动物模型中,我们也观察到了相似的结果。为更深入地研究AKR1B10在肺癌形成、进展和防治中的作用,我们应用四环素诱导的基因表达系统技术(BLOCK-iTTM Inducible H1 RNAi Entry Vector Kit, Invitogen)建立了四环素调控AKR1B10表达的细胞模型。首先转染调节TetR表达的重组质粒(pcDNA6/TR)到NCI-H460细胞中,用10μg/ml blasticidin筛选得到稳定克隆。再用PCR、RT-PCR技术检测得到高表达TetR的阳性克隆。然后再转染诱导AKR1B10siRNA表达的重组质粒(pENTRH1/TO/siRNA)到这些表达TetR的细胞克隆中。用400μg/ml zeocin筛选得到的稳定克隆又经过3μg/ml强力霉素(Doxycycline,四环素类)诱导检测,从而得到AKR1B10表达受四环素调节的细胞克隆,扩增冻存这些细胞以后备用。这些研究结果表明：AKR1B10既通过代谢醛酮类物质而调节它在细胞内的水平,又通过影响脂质合成、线粒体功能和氧化状况,在结肠癌细胞和肺癌细胞生长中起了重要作用。AKR1B10也影响了动物肿瘤模型中肺癌的形成和进展。这些结果为靶向AKR1B10的肺癌治疗提供重要的实验依据和理论基础。这个研究也建立了一个四环素诱导AKR1B10沉默的细胞模型,为肺癌干预和药物研发提供了方便、经济的实验工具。

全文目录

中文摘要  3-7
英文摘要  7-13
缩写词对照表  13-14
前言  14-17
第一部分 ACCA抑制或沉默诱导了结肠癌和非小细胞型肺癌细胞凋亡  17-29
  第一节材料和方法  19-23
  第二节结果  23-27
  第三节讨论  27-29
第二部分 AKR1B10通过调节脂质合成和消除醛酮化合物促进肿瘤细胞存活  29-45
  第一节材料和方法  31-36
  第二节结果  36-43
  第三节讨论  43-45
第三部分 AKR1B10在肺癌生长中的作用  45-74
  第一章 RNA干扰介导的AKR1B10沉默对非小细胞型肺癌的体内体外抑制作用  45-65
    第一节材料和方法  47-52
    第二节结果  52-63
    第三节讨论  63-65
  第二章四环素调节AKR1B10表达细胞模型的建立  65-74
    第一节材料和方法  67-71
    第二节结果  71-73
    第三节讨论  73-74
结论  74-75
参考文献  75-90
附录文献综述  90-132
致谢  132-133
攻读学位期间主要的研究成果目录  133

AKR1B10在结肠癌和肺癌细胞生长中的作用及机制

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