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两种新型避孕材料遗传毒性的研究

作 者: 陈淑剑
导 师: 黄勋彬
学 校: 华中科技大学
专 业: 妇产科学
关键词: 络合铜纳米高分子复合材料 细胞毒性 铜丝 MTT TM4细胞 彗星试验 台盼蓝排斥试验 DNA损伤 Ames试验 模拟体液 铜离子 新型无铜纳米高分子复合材料 遗传毒性
分类号: R114
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


第一部分新型含铜避孕材料与含铜宫内节育器(HCu280)细胞毒性遗传毒性的对比研究考察新型络合铜纳米高分子复合材料的细胞毒性与遗传毒性,同时鉴于铜离子的抗生育作用,将市售含铜宫内节育器(HCu280)上铜丝的细胞毒性与遗传毒性与该新型材料进行对比研究,从而为该材料在临床的应用提供可靠的信息。实验一络合铜纳米高分子复合材料与HCu280体外细胞毒性试验比较(MTT比色法)目的:通过比较络合铜纳米高分子复合材料与取自含铜宫内节育器(HCu280)上的铜丝进行体外细胞毒性的比较,为后续进行的遗传毒性试验选择合适的浓度。方法:采用MTT比色试验检测这两种材料不同浓度浸提液染毒24小时对TM4细胞活率的影响。经火焰法原子吸收光谱仪检测铜离子的浓度,评价络合铜纳米高分子复合材料3个浓度[100%(8.54μg/ml),50%(4.27μg/ml),25%(2.135μg/ml)]浸提液样品。鉴于铜离子的浓度,将含铜宫内节育器上铜丝的浸提液用完全培养基依次倍比稀释为7个浓度[100%(106.54μg/ml) , 50%(53.27μg/ml) , 25%(26.64μg/ml) , 12.5% (13.32μg/ml) , 6.25%(6.66μg/ml) , 3.125%(3.33μg/ml) , 1.5625% (1.67μg/ml)]样品。染毒后,在酶标仪492nm波长处检测各样品吸光度值,得出细胞相对增殖度,根据细胞毒性评定六级反应评定材料的毒性程度。结果:新型络合铜纳米高分子复合材料不同浓度浸提液样品的细胞相对增殖度在87.3%-92.1%范围,细胞毒性评定为1级;HCu280组的7个浓度样品呈现浓度-效应关系,浸提原液细胞毒性过大,细胞相对增殖度接近0,对应的毒性程度为5级,50%,25%,12.5%铜丝样品组所对应的相对增殖度分别为5.76%,27.58%,47.8%,体外细胞毒性试验评定不合格。而6.25%,3.125%,1.5625%三个样品组所对应的细胞毒性反应为1级。结论:新型络合铜纳米高分子材料不同浓度浸提液对TM4细胞无明显细胞毒性,符合ISO10993-5:2009和GB/T16886.5-2003规定关于生物材料体外细胞毒性试验评价的要求。因此,将选取该新型材料组3个浓度样品(100%,50%,25%)进行彗星试验以检测其潜在的遗传毒性。铜离子所致细胞毒性依赖于铜离子浓度。含铜宫内节育器(HCu280)浸提液标本选取6.25%,3.125%,1.5625%进行DNA损伤的检测。实验二络合铜纳米高分子复合材料与HCu280体外遗传毒性的比较(彗星试验)目的:考察比较新型络合铜纳米高分子复合材料与铜丝对TM4细胞DNA断裂的影响。方法:基于MTT试验的结果,将新型络合铜纳米高分子复合材料不同浓度浸提液[100%(8.54μg/ml),50%(4.27μg/ml),25%(2.135μg/ml)]以及含铜宫内节育器铜丝浸提液3个无明显细胞毒性的样品[6.25%(6.66μg/ml), 3.125%(3.33μg/ml),1.5625%(1.67μg/ml)]作用于TM4细胞,24小时后各样品组进行台盼蓝排斥试验,以确认各样品对TM4细胞活率的影响。通过彗星试验检测各样品对DNA损伤的作用。以Olive尾距作为评价DNA损伤的参数。结果:台盼蓝排斥试验显示各样品组染毒24小时后细胞活率均大于90%。彗星试验结果显示,阴性对照组Olive尾距为0.87±0.22,而阳性对照组为13.78±2.21,约为阴性对照组的16倍;新型络合铜高分子复合材料3个浓度的样品均导致了DNA损伤(P<0.05),并呈现浓度-效应关系。其中浸提原液组Olive尾距约为阴性对照组10倍。含铜宫内节育器铜丝浸提液3个浓度中,6.25%(6.66μg/ml), 3.125%(3.33μg/ml)两个浓度诱发了DNA断裂,且与阴性对照组相比有显著性差异( P<0.05 ),而1.5625%(1.67μg/ml)浓度组Olive尾距与阴性对照组相比无显著性差异(P>0.05)。结论:新型络合铜纳米高分子复合材料3个浓度的样品在没有影响细胞活率的情况下导致了遗传毒性,而铜丝浸提液样品也导致了DNA损伤。考虑到彗星试验中各浸提液样品中铜离子的浓度以及MTT试验结果,我们推测新型材料所产生的遗传毒性可能与铜离子有关。实验三络合铜纳米高分子复合材料与HCu280体外遗传毒性的比较(Ames试验)目的:进一步考察并比较新型络合铜纳米高分子复合材料与含铜宫内节育器HCu280铜丝浸提液的遗传毒性。方法:用模拟体液浸提两种材料,经火焰法原子吸收光谱仪测得新型材料与含铜宫内节育器铜丝浸提原液中铜离子浓度分别为6.84μg/ml,197.0μg/ml。将新型材料浸提液用模拟体液依次倍比稀释为100%(6.84μg/ml),50%(3.42μg/ml),25%(1.71μg/ml)和12.5%(0.855μg/ml)四个浓度。鉴于MTT试验与彗星试验结果,将含铜宫内节育器铜丝材料浸提原液(197.0μg/ml)稀释至6.84μg/ml,以此为最高浓度,依次用模拟体液稀释为浓度2(3.42μg/ml),浓度3(1.71μg/ml),浓度4(0.855μg/ml)四个浓度。采用Ames试验标准平板掺入法,用TA98和TA100两种菌株,在加与不加代谢活化系统大鼠肝微粒体酶(S9)的情况下检测各样品的致突变效应。以突变率(MR值)评定结果的参数。结果:在不加S9时,溶剂对照组自发回变菌落数TA98为21.5±0.5,TA100为174.25±1.5;加入S9时,TA98为19.5±0.25,TA100为145.2±1.2。阳性对照组在加与不加S9时,突变菌落数明显增高,说明该试验具可行性。在加与不加S9时,新型材料25%-100%样品组在TA98菌株的诱发突变菌落数超过了溶剂对照组的两倍(MR>2),并呈现浓度-效应关系,提示这些样品可诱发移码型突变。对TA100菌株,与溶剂对照组相比,50%与100%样品组诱发的回变菌落数增幅不是很大却结果呈阳性(MR>2)。最低浓度12.5%样品组没有导致显著性回复突变(除外TA98菌株在不加S9的情况下)。铜丝浸提液各检测样品呈现了与新型材料组相同的趋势,经过比较在铜离子浓度相同时,所对应的新型材料浸提液样品与铜丝浸提液样品在加与不加S9的情况下,对于TA98和TA100两种检测菌株,相应的MR值间比较无显著性差异(P>0.05)。另外,在加入S9后,多数样品诱发突变菌落数降低,提示S9中的多功能的单加氧酶可能对致突变物有解毒作用。结论:Ames试验在彗星试验基础上,进一步提示新型络合铜纳米高分子复合材料浸提液可能导致遗传毒性,而且经过与相同铜离子浓度的含铜宫内节育器铜丝浸提液进行比较,进一步提示该新型材料所导致的遗传毒性与材料中释放的铜离子相关。目的:鉴于铜离子体外遗传毒性试验可能导致遗传物质损伤,考察用于男性输精管节育装置的新型无铜纳米高分子复合材料的体外遗传毒性。方法:首先检测该新型材料的细胞毒性,运用MTT比色法,检测该材料不同浓度浸提液(100%,50%,25%)对TM4细胞活率的影响;然后采用彗星试验,检测这三个浓度浸提液对TM4细胞DNA损伤的影响;同时结合Ames试验,检测该新型材料在模拟体液浸提120小时后,100%,50%,25%,12.5%四个浓度样品在加与不加S9时,对两种组氨酸缺陷型菌株(TA98,TA100)的致突变作用。结果:MTT比色试验显示,该材料浸提液在100%,50%,25%时均未出现细胞生长抑制,细胞毒性程度为0-1级;彗星试验结果显示,以上三个浓度均未导致明显DNA断裂,Olive尾距与阴性对照组比较无显著性差异(P>0.05);Ames试验结果表明,在加与不加S9时,对于两种检测菌株,各浓度样品MR值均小于2,新型无铜纳米高分子复合材料无致突变作用。结论:经过一系列体外细胞毒性及遗传毒性试验,用于输精管节育装置的新型纳米高分子复合材料显示出良好的生物相容性,有望成为新型安全的男性避孕材料。

全文目录


前言  6-10
中文摘要  10-15
英文摘要  15-21
第一部分 新型含铜避孕材料与含铜宫内节育器(HCu280)细胞毒性遗传毒性的对比研究  21-50
  实验一 络合铜纳米高分子复合材料与HCu280 体外细胞毒性试验比较  21-33
    引言  21
    材料与方法  21-27
    结果  27-30
    讨论  30-33
  实验二 络合铜纳米高分子复合材料与HCu280 体外遗传毒性的比较(彗星试验  33-42
    引言  33
    材料与方法  33-38
    结果  38-40
    讨论  40-42
  实验三 络合铜纳米高分子复合材料与HCu280体外遗传毒性的比较(Ames试验  42-50
    引言  42
    材料与方法  42-46
    结果  46-47
    讨论  47-49
    结论  49-50
第二部分 用于输精管节育装置的新型无铜材料体外细胞毒性与遗传毒性的研究  50-60
  引言  50-51
  实验一 无铜纳米高分子复合材料体外细胞毒性的研究  51-52
    材料与方法  51
    结果  51-52
  实验二 无铜纳米高分子复合材料体外遗传毒性的研究(彗星试验  52-54
    材料与方法  52-53
    结果  53-54
  实验三 无铜纳米高分子复合材料体外遗传毒性的研究(Ames 试验  54
    材料与方法  54
    结果  54
  结论  54-55
  参考文献  55-60
综述  60-72
  参考文献  68-72
附录1 (攻读学位期间发表论文)  72-87
附录2 (英文缩略词)  87-88
致谢  88-89

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中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 卫生基础科学 > 卫生毒理
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