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猪诱导性多潜能干细胞的建立

作　者: 殷慧群
导　师: 章孝荣
学　校: 安徽农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 成纤维细胞 诱导性多能干细胞(iPS细胞) 限定因子 融合蛋白 猪
分类号: Q813
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


猪诱导性多潜能干细胞的建立诱导性多潜能干细胞（iPS细胞）是指通过在分化的体细胞中表达特定的转录因子来诱导其发生重编程而获得的可不断自我更新和具有多向分化潜能的细胞。iPS细胞技术的产生和发展,是干细胞领域乃至整个生物学领域的一项重大发现,具有广阔的应用前景。本研究旨在应用限定因子建立猪iPS细胞诱导技术,为将来深入研究应用猪iPS细胞奠定基础。论文由三个试验组成,其内容如下:试验一:携带限定因子的慢病毒表达载体的构建以胎猪原始生殖嵴和囊胚为材料,用RT-PCR方法克隆出猪Sox2、Klf4和c-Myc基因的开放阅读框序列,人OCT4基因序列直接从质粒pMX-hOCT4中扩增获取。经限制性内切酶酶切,与逆转录病毒载体pLEGFP-N1连接,分别构建出限定因子EGFP融合蛋白逆转录病毒表达载体。再从重组逆转录病毒载体中扩增出CMV启动子,限定因子和EGFP序列,同时通过酶切从pLL3.7质粒中移除U6启动子、CMV启动子和EGFP序列,最后把扩增出的CMV启动子,限定因子和EGFP序列与改造后的pLL3.7进行重组,分别构建出限定因子EGFP融合蛋白慢病毒表达载体pLL-hOCT4/pSox2/pKlf4/pMyc -EGFP。重组慢病毒载体质粒转染293T细胞后,在荧光显微镜下观察限定因子表达情况。结果显示,猪Sox2、Klf4和c-Myc基因开放阅读框序列分别与已发表的猪Sox2、Klf4和c-Myc基因序列高度同源;重组慢病毒载体质粒转染293T细胞后表现为限定因子EGFP融合蛋白定位于细胞核表达,符合限定因子表达特点。这些结果证实,本试验的限定因子EGFP融合蛋白慢病毒载体构建正确。试验二:慢病毒载体法诱导猪iPS细胞采用组织块培养法从57d胎龄的杜洛克-长白-大约克三元杂交猪胎儿分离培养建立7株猪胎儿成纤维细胞系。通过磷酸钙法转染四种限定因子EGFP融合蛋白慢病毒表达载体质粒和包装辅助质粒,包装产生的四种限定因子慢病毒经浓缩后感染猪胎儿成纤维细胞,在含1000U/mL LIF和4ng/mL bFGF的干细胞培养液培养条件下进行培养传代,逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆,高倍显微镜下集落中的单个细胞呈现细胞核较大,核质比例较高。按1∶4比例每34 d传代一次,细胞集落生长稳定,核型正常,AP检测为阳性,免疫细胞化学和RT-PCR检测有关键性多潜能相关基因Oct4和Nanog的表达。此外,细胞集落中SSEA-1蛋白表达检测阳性,SSEA-3/4和TRA-1-61/81检测阴性。将其注射到BALB/cA裸鼠背侧皮下可形成含有外胚层、中胚层和内胚层组织来源的畸胎瘤。以上结果证实,本试验所获得的猪的细胞克隆具有ES细胞样特征,即成功地从猪胎儿成纤维细胞诱导出iPS细胞。试验三:纯化蛋白穿膜法诱导猪iPS细胞由于慢病毒携带外源基因的随机稳定整合会带来潜在的细胞癌化畸变等危害,因此根据慢病毒介导外源限定因子EGFP融合蛋白的试验结果,构建携带细胞穿膜肽外源限定因子的融合蛋白用于猪iPS细胞的诱导,将会为猪iPS细胞的安全生产、应用奠定基础。将体外表达、纯化的携带有细胞穿膜肽——九聚精氨酸（R9）的限定因子-R9融合蛋白添加到培养的猪胎儿成纤维细胞培养液中尝试建立猪iPS细胞。结果显示,在荧光显微镜下可观察到限定因子-R9原核蛋白能进入猪胎儿成纤维细胞,且蛋白能定位于细胞核;在干细胞培养液培养条件下同时用限定因子-R9原核蛋白处理6个周期后,能逐渐分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆,重构克隆中的单个细胞呈现细胞核较大,核质比例较高,AP为阳性,免疫细胞化学检测ES细胞特异性分子标记Oct4和Nanog蛋白表达阳性。这些结果证实本试验的限定因子-R9原核蛋白表达载体构建正确;细胞穿膜肽R9可转导限定因子重组蛋白进入细胞核;重组限定因子-R9原核蛋白可使猪胎儿成纤维细胞发生重构,且重构细胞具有ES细胞样形态,可表达AP、Oct4和Nanog蛋白。综合以上三个试验的研究结果,可以得出如下结论:1.运用RT-PCR技术可以从胎猪的原始生殖嵴和囊胚细胞克隆出猪Sox2、Klf4和c-Myc限定因子基因的开放阅读框序列;用基因工程技术将这些限定因子基因序列（包括人Oct4基因序列）与逆转录病毒载体pLEGFP-N1连接,再进行基因重组,能成功地构建限定因子EGFP融合蛋白慢病毒表达载体。应用这些重组限定因子EGFP融合蛋白可有效追踪掌握限定因子在细胞重编程过程中的作用机制和特点。2.用限定因子EGFP融合蛋白慢病毒能诱导猪胎儿成纤维细胞重编程,建立猪iPS细胞。通过限定因子EGFP融合蛋白追踪发现,外源限定因子在猪iPS细胞集落中大多数不表达或低水平表达,少数细胞高表达,提示体细胞完全重编程形成iPS细胞后外源基因不表达,不完全重编程的体细胞外源基因仍处于高表达状态;不同的猪胎儿成纤维细胞可能需要不同的时间去完成重编程进程,或者不同的细胞可能是在不同的时间点上启动重编程进程。3.将携带有细胞穿膜肽——九聚精氨酸（R9）的限定因子重组蛋白用于猪胎儿成纤维细胞的重编程,获得了具有ES细胞样形态、可表达AP、Oct4和Nanog蛋白的重构细胞,为建立诱导猪体细胞直接重编程的新方法提供了新的思路。本论文的创新点:首次应用含有猪源性限定因子EGFP融合蛋白慢病毒成功建立猪iPS细胞。首次尝试应用限定因子重组蛋白直接重编程猪胎儿成纤维细胞。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-14
插图清单  14-16
缩略词表  16-19
文献综述  19-54
  1 细胞核重编程技术  19-23
    1.1 体细胞核移植  20-21
    1.2 体细胞与多潜能干细胞融合  21-22
    1.3 体细胞与多能性细胞提取物共孵育  22-23
  2 iPS 细胞系的建立及其优化方案  23-36
    2.1 限定因子的选择  23-27
      2.1.1 限定因子的发现  23-25
      2.1.2 限定因子的选择和小分子的应用  25-27
    2.2 限定因子运载系统  27-31
    2.3 靶细胞类型的选择  31-32
    2.4 限定因子的表达参数  32-33
    2.5 获取iPS 细胞的培养条件  33-34
    2.6 iPS 细胞克隆的识别  34-35
    2.7 iPS 细胞克隆的鉴定  35-36
  3 iPS 细胞建立的模型假说  36-39
    3.1 原种模型假说  36-37
      3.1.1 已决定原种模型  37
      3.1.2 诱导原种模型  37
    3.2 随机模型假说  37-39
  4 iPS 细胞建立的分子机制  39-49
    4.1 限定因子诱导多能性的可能机制  40-45
      4.1.1 四种限定因子简介  40-42
      4.1.2 Oct4/Sox2/Nanog 自动调节环及转录调控网络  42-43
      4.1.3 ES 细胞的信号转导通路  43-44
      4.1.4 限定因子诱导多能性的可能机制  44-45
    4.2 iPS 细胞表观遗传特征建立的可能机制  45-47
      4.2.1 ES 细胞的表观遗传特征  45-46
      4.2.2 iPS 细胞建立的表观遗传特征要求及可能机制  46-47
    4.3 iPS 细胞产生过程中的可能分子机制  47-49
      4.3.1 重编程进程中细胞分子特征变化  47-48
      4.3.2 重编程进程中的可能分子机制  48-49
  5 ES 细胞与iPS 细胞差异  49-50
  6 iPS 细胞的应用前景  50-52
    6.1 iPS 细胞应用于治疗的前景  50-51
    6.2 iPS 细胞在家畜上的应用前景  51-52
  7 展望  52-54
研究论文  54-57
第一章 限定因子慢病毒表达载体的构建  57-82
  摘要  57
  前言  57-58
  1 材料与方法  58-67
    1.1 材料  58
    1.2 溶液配制  58-59
    1.3 引物合成和DNA 测序  59
    1.4 试验仪器、分子试剂及试剂盒  59-60
    1.5 方法  60-67
      1.5.1 限定因子基因的克隆  60-64
      1.5.2 限定因子基因逆转录病毒载体的构建  64-65
      1.5.3 pLL3.7 慢病毒载体的改造  65-66
      1.5.4 限定因子慢病毒载体的构建  66-67
      1.5.5 重组质粒在293T 细胞中的表达  67
  2 结果  67-78
    2.1 限定因子基因克隆和测序的结果  67-68
      2.1.1 限定因子基因克隆的结果  67-68
      2.1.2 限定因子基因测序的结果  68
    2.2 重组逆转录病毒载体构建的结果  68-69
    2.3 pLL3.7 慢病毒载体改造的结果  69
    2.4 重组慢病毒载体构建的结果  69
    2.5 质粒转染293T 细胞的结果  69-78
  3 讨论  78-81
    3.1 关于限定因子基因克隆  78-80
    3.2 关于重组慢病毒载体质粒的构建  80-81
  4 小结  81-82
第二章 限定因子慢病毒诱导猪iPS 细胞的建立和鉴定  82-104
  摘要  82
  前言  82-84
  1 材料与方法  84-92
    1.1 材料  84
    1.2 溶液配制  84-85
    1.3 仪器及耗材  85
    1.4 方法  85-92
      1.4.1 猪胎儿成纤维细胞系（PFFs）的建立  85-87
      1.4.2 饲养层的制备  87-88
      1.4.3 慢病毒的包装、收集浓缩和感染  88-89
      1.4.4 限定因子慢病毒诱导猪胎儿成纤维细胞的重构  89
      1.4.5 猪iPS 细胞的传代培养  89
      1.4.6 猪iPS 细胞的冻存  89-90
      1.4.7 猪iPS 细胞的复苏  90
      1.4.8 碱性磷酸酶染色  90
      1.4.9 免疫荧光染色分析  90-91
      1.4.10 细胞染色体计数分析  91
      1.4.11 RT-PCR 检测  91-92
      1.4.12 体内分化检测  92
  2 结果  92-99
    2.1 猪胎儿成纤维细胞系建立的结果  92-93
    2.2 猪iPS 细胞建立的结果  93
    2.3 猪iPS 细胞鉴定的结果  93-99
      2.3.1 猪iPS 细胞表达了碱性磷酸酶  93
      2.3.2 猪iPS 细胞有多能性基因的表达  93-94
      2.3.3 猪iPS 细胞核型正常  94
      2.3.4 猪iPS 细胞有ES 细胞特异性分子标记的表达  94
      2.3.5 猪iPS 细胞有多向分化潜能  94-99
  3 讨论  99-103
    3.1 关于靶细胞的选择  99
    3.2 关于建立的猪胎儿成纤维细胞系  99-100
    3.3 关于选择的限定因子  100
    3.4 关于猪iPS 细胞诱导和维持培养液的确定  100-101
    3.5 关于猪iPS 细胞的诱导效率  101
    3.6 关于猪iPS 细胞特征  101-103
  4 小结  103-104
第三章 限定因子重组蛋白重编程猪胎儿成纤维细胞的初步探讨  104-119
  摘要  104
  前言  104-105
  1 材料与方法  105-109
    1.1 材料  105
    1.2 溶液配制与分子试剂  105-106
    1.3 仪器及耗材  106
    1.4 方法  106-109
      1.4.1 限定因子-R9 原核蛋白表达载体的构建  106-107
      1.4.2 限定因子-R9 原核蛋白的诱导表达  107
      1.4.3 限定因子R9 原核蛋白的提取纯化  107-108
      1.4.4 限定因子R9 原核蛋白对猪胎儿成纤维细胞的重构  108
      1.4.5 重构细胞的碱性磷酸酶染色  108
      1.4.6 重构细胞的免疫荧光染色分析  108-109
  2 结果  109-116
    2.1 限定因子-R9 原核蛋白表达载体构建的结果  109
    2.2 限定因子-R9 原核蛋白的诱导表达及SDS-PAGE 检测的结果  109
    2.3 限定因子-R9 原核蛋白对猪胎儿成纤维细胞的重构结果  109-116
  3 讨论  116-118
    3.1 关于限定因子-R9 原核蛋白载体的构建及重组蛋白的转导活性  116
    3.2 关于限定因子-R9 原核蛋白对猪胎儿成纤维细胞的重构  116-118
  4 小结  118-119
全文结论  119-121
参考文献  121-135
致谢  135-137
作者简介  137

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 细胞工程
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