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兔骨髓间充质干细胞分离培养及定向分化的研究

作 者: 和小娥
导 师: 王新庄
学 校: 河南农业大学
专 业: 临床兽医学
关键词: 骨髓间充质干细胞 碱性成纤维细胞生长因子 脂肪细胞 分化 
分类号: R329
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 18次
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内容摘要


骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)起源于中胚层,主要存在于哺乳动物的骨髓中,与造血干细胞(Hemopoietic stem cells,HSCs)共存。BMSCs不仅参与构建造血微环境,发挥支持造血的作用,而且易于体外分离培养和扩增、可自体移植并具有跨胚层分化为多种细胞类型的能力,未分化的或经遗传修饰过的BMSCs有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的理想种子细胞。本研究目的在于阐明BMSCs的生物学特性,优化兔BMSCs的增殖培养条件,并研究其分化为脂肪细胞的潜能,以便未来利用该类细胞作为疾病细胞和基因治疗的模型。为此,本试验利用一月龄日本大白兔为对象,较为系统全面地研究了其BMSCs的分离、培养、扩增、鉴定、形态学、生长特性及体外诱导分化能力,为进一步深入研究BMSCs的诱导分化和应用打下实验基础。1.本试验应用红细胞裂解液法,根据骨髓间充质干细胞在培养瓶中贴壁生长的特点,成功分离得到兔股骨和胫骨MSCs,体外培养至第7代。本试验所分离的兔BMSCs,增殖能力强,体外适应性较好,通过绘制细胞生长曲线、测定24h贴壁率得出,随着传代次数的增多,增殖能力下降,贴壁时间延长,选用前4代传代细胞作为进一步的研究对象最为合适;经免疫组化实验得出兔BMSCs表面标志CD90、CD44阳性表达,CD34阴性,可初步鉴定所分离的细胞为兔BMSCs,为进一步的实验奠定基础。2.本试验通过四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)比较不同培养基及血清浓度对兔BMSCs生长的影响,结果发现不加血清时,细胞在LG-DMEM和DMEM/F12中的生长速度没有显著差异( P >0.05),加血清后,细胞在DMEM/F12中的生长速度均比在LG-DMEM中的生长速度快(P﹤0.05),其中兔骨髓间充质干细胞在DMEM/F12+20%FBS培养基中生长速度最快。另外,在LG-DMEM+10% FBS培养液中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),通过MTT法来检测bFGF对体外培养的兔骨髓MSCs增殖的影响,结果表明,bFGF具有促进体外培养的兔BMSCs增殖的作用,其促增殖效应与其质量浓度关系密切:5~20μg/L效应不明显(P>0.05),在40~100μg/L时促增殖效应显著(P <0.05),在80μg/L时其促增殖效应最强(P <0.01)。通过检测细胞周期分析bFGF促进兔BMSCs增殖的机理,结果表明,添加bFGF组的细胞中处于S+G2/M期(增殖指数)的细胞百分率为(32.83±1.47)%,与对照组(17.19±1.38)%相比明显增加(P﹤0.01)。3.联合应用地塞米松、胰岛素体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞分化,诱导7d后细胞内有脂滴,随着时间延长,脂滴逐渐增加并融合为脂泡,细胞体积逐渐增大由原来的长梭形变为椭圆形或多角形,胞核被挤向一侧,油红O染色呈阳性,从而建立了MSCs分化为脂肪细胞的模型,有助于研究肥胖发生的机制。同时,这也是和骨髓造血干细胞的区别之一。

全文目录


致谢  5-9摘要  9-10文献综述  10-20  1 骨髓间充质干细胞的研究进展  10-20    1.1 骨髓间充质干细胞的发现及其命名  10    1.2 骨髓间充质干细胞的生物学特性  10-12    1.3 骨髓间充质干细胞的分离纯化与培养扩增  12-14      1.3.1 MSCs 的分离纯化  12-13      1.3.2 MSCs 的培养扩增  13-14    1.4 骨髓间充质干细胞的鉴定  14-15      1.4.1 形态学  14      1.4.2 MSCs 的表面标志  14-15      1.4.3 免疫细胞化学技术  15      1.4.4 流式细胞技术  15    1.5 骨髓间充质干细胞的可塑性  15-17      1.5.1 MSCs 向成骨细胞的定向诱导分化  16      1.5.2 MSCs 向软骨细胞的定向诱导分化  16      1.5.3 MSCs 向脂肪细胞的定向诱导分化  16      1.5.4 MSCs向神经细胞的定向分化  16-17      1.5.5 MSCs向肝细胞的定向诱导分化  17      1.5.6 MSCs向肌腱组织分化  17      1.5.7 MSCs向表皮细胞分化  17    1.6 骨髓间充质干细胞的应用前景及存在的问题  17-20      1.6.1 应用前景  17-18      1.6.2 存在的问题  18-20试验一 骨髓间充质干细胞分离、培养、鉴定及生物学特 性的研究  20-30  引言  20  1 材料与方法  20-23    1.1 试验材料  20-21    1.2 主要溶液配制  21    1.3 试验方法  21-23    1.4 统计学处理  23  2 结果与分析  23-27    2.1 原代培养  23-24    2.2 传代培养  24-25    2.3 兔骨髓间充质干细胞的鉴定  25-26    2.4 传代兔骨髓间充质干细胞生长曲线的测定  26-27    2.5 传代细胞贴壁率  27  3 讨论  27-29    3.1 兔骨髓间充质干细胞的分离培养  28    3.2 传代次数对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响  28-29    3.3 兔骨髓间充质干细胞的鉴定  29  4 小结  29-30试验二 兔骨髓间充质干细胞体外扩增培养影响因素的实 验研究  30-37  引言  30  1 材料与方法  30-32    1.1 试验材料  30    1.2 主要溶液配制  30-31    1.3 试验方法  31-32    1.4 统计学处理  32  2 结果与分析  32-35    2.1 兔 BMSCs 体外培养基的筛选  32-33    2.2 MTT 比色实验测得 bFGF 对兔 BMSCs 的促增殖效应  33-35  3 讨论  35-36  4 小结  36-37试验三 兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为脂肪细胞的 研究  37-41  引言  37  1 材料与方法  37-38  2 结果与分析  38-39  3 讨论  39-40  4 小结  40-41结论  41-42参考文献  42-51英文缩写词表  51-52ABSTRACT  52-54作者简介  54

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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