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利用限定因子诱导牛iPS细胞

作　者: 孙雪萍
导　师: 刘亚；曹鸿国
学　校: 安徽农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 牛胎儿成纤维细胞限定因子 iPS细胞
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

iPS细胞在家畜新品种培育及细胞重编程机制的研究中具有重要意义。本研究采用慢病毒感染法以融合有绿色荧光蛋白的pSox2、hOct4、pMyc和pKlf4四种限定因子诱导牛胎儿皮肤成纤维细胞为iPS细胞,并对形成的iPS细胞克隆进行鉴定。试验结果如下:牛胎儿成纤维细胞经过慢病毒感染后的第15 d开始发生形态改变,由长梭形变成边缘不规则的圆球形。接到饲养层后细胞贴附生长,形态改变的细胞不但数量增多,而且聚集一起呈扁平克隆状致密生长,边界清楚。高倍镜下观察牛iPS克隆细胞核较大,核质比率较高,荧光下观察牛iPS克隆中有部分细胞能够表达绿色荧光蛋白。进一步传代培养,牛iPS细胞克隆数不断增多,而且传至十几代后仍保持稳定增长。冻存-复苏后的细胞继续保持稳定的传代培养性能。待细胞接到饲养层后随着iPS细胞克隆的增殖和稳定传代,绿色荧光表达强度逐渐减弱,而且表达绿色荧光蛋白的克隆也逐渐减少。秋水仙素处理牛iPS细胞克隆进行核型分析检测,结果显示诱导出的牛iPS细胞染色体条数为60,与正常的牛细胞核型相吻合;碱性磷酸酶染色呈阳性。RT-PCR扩增鉴定iPS细胞克隆中多潜能相关基因Oct4、Sox2、Nanog、c-Myc和Klf4的表达情况,结果Oct4、Nanog、c-Myc和Klf4均呈阳性,Sox2为阴性,而作为对照的牛胎儿成纤维细胞中均无上述5种基因的表达。免疫荧光染色法对牛iPS细胞克隆中多能性相关基因的蛋白进行检测,Oct4和Nanog蛋白呈阳性,但其余蛋白表达均呈现阴性。牛iPS细胞克隆在体外悬浮培养的第10 d,可观察到拟胚体的形成,并且拟胚体易于聚集融合。将牛iPS细胞多点多次注射到裸鼠背侧皮下,6周后在裸鼠注射部位成功长出大小不等的多个畸胎瘤,取出的畸胎瘤形态呈不规则的圆球状,被一层白膜包裹,质地柔软,侵袭性强,畸胎瘤表面分布很多血管与裸鼠皮下组织相连。经组织切片和HE染色可观察到裸鼠皮下生长的畸胎瘤中存在由内、中、外三胚层分化而来的组织。结论:利用限定因子pSox2、hOct4、pc-Myc和pKlf4成功将牛胎儿成纤维细胞诱导为牛iPS细胞。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-10
表格和插图清单  10-11
缩略词表  11-12
文献综述  12-20
引言  20-21
1 材料和方法  21-28
  1.1 试验材料  21-22
    1.1.1 试验动物  21
    1.1.2 重组质粒  21
    1.1.3 主要试剂与溶液  21
    1.1.4 主要仪器  21
    1.1.5 试剂与溶液配制  21-22
  1.2 试验方法  22-28
    1.2.1 牛胎儿成纤维细胞的分离和培养  22
    1.2.2 鼠胎儿成纤维细胞的分离和培养  22-23
    1.2.3 饲养层制备  23
    1.2.4 慢病毒的包装、收集和感染  23-24
    1.2.5 牛iPS 细胞的诱导和培养  24
    1.2.6 细胞染色体制片  24-25
    1.2.7 碱性磷酸酶染色  25
    1.2.8 RT-PCR 检测  25-26
    1.2.9 免疫荧光细胞染色  26-27
    1.2.10 体外分化能力检测  27
    1.2.11 体内分化能力检测  27-28
2 试验结果与分析  28-34
  2.1 牛iPS 细胞的形态特点  28-29
  2.2 核型分析  29
  2.3 碱性磷酸酶检测结果分析  29
  2.4 基因表达检测结果分析  29-30
  2.5 免疫细胞化学分析  30
  2.6 拟胚体的形成  30-32
  2.7 畸胎瘤的形成与检测  32-34
3 讨论  34-37
  3.1 病毒载体对牛iPS 细胞形成的影响  34
  3.2 限定因子对牛iPS 细胞形成的影响  34
  3.3 牛iPS 细胞中外源基因的沉默情况  34-35
  3.4 不同物种iPS 细胞特异性表面标记物的区别  35-36
  3.5 牛iPS 细胞与ES 细胞的差异  36-37
4 结论  37-38
参考文献  38-45
致谢  45-47
个人简介  47

利用限定因子诱导牛iPS细胞

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