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猪CD163基因的克隆表达及其抗体制备

作　者: 郭娟娟
导　师: 张德礼；田志军
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: CD163 克隆表达多克隆抗体单克隆抗体
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus, PRRSV)是一种严重危害养猪业的主要病原。PRRSV主要以肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages, PAM)作为靶细胞,通过与宿主细胞受体相互作用,引起机体过强天然免疫应答和适应性免疫应答。CD163是存在于单核-巨嗜细胞表面的特异性受体,属于I型跨膜蛋白。PRRSV非允许细胞系在瞬时和稳定表达CD163分子后均支持I型和II型PRRSV感染,并产生子代病毒粒子,表明CD163分子在病毒粒子脱壳释放过程中发挥作用。在PRRSV感染过程中,受体CD163的SRCR5结构域与PRRSV的糖基化膜蛋白GP2和GP4相互作用,促进病毒脱壳,病毒粒子从酸性小泡释放到胞浆中开始转录翻译形成新的病毒粒子,而删除CD163分子的胞质尾区可以促进PRRSV的复制增殖。为了解CD163 SRCRs结构域在PRRSV感染过程中的功能以及CD163与其它受体的相互作用机制,本研究原核表达并纯化CD163蛋白的胞质外区SRCR4-SRCR5,免疫新西兰白兔和BALB/c小鼠,制备了兔抗猪CD163多克隆抗体及单克隆抗体并进行抗体功能鉴定。实验结果如下:1.构建了表达猪CD163基因胞质外区SRCR4-SRCR5的原核表达载体pGEX-6P-CD163,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析证实获得了相应大小的融合蛋白GST-CD163。2.通过切胶纯化方法对GST-CD163融合蛋白进行纯化,得到纯度较高的目的蛋白。将纯化蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗猪CD163多克隆抗体,并通过流式细胞技术和抗体阻断实验对多克隆抗体进行鉴定。3.纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞用50% PEG(4000)进行融合。采用间接ELISA方法和Western Blot检测融合后存活的细胞。通过有限稀释法筛选得到1株抗GST阳性杂交瘤细胞株,命名为3E2F2;抗CD163的阳性克隆细胞株还在进一步筛选中。在本研究中,我们获得兔抗猪CD163多克隆抗体及一株抗GST的单克隆抗体的杂交瘤细胞,分泌CD163单克隆抗体的杂交瘤细胞还在进一步筛选中。如果能够得到一株分泌CD163抗体的单克隆细胞,将为进一步研究CD163受体在PRRSV感染过程中发挥的具体作用奠定基础。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-12
文献综述  12-22
  第一章 CD163 分子及其在PRRSV 感染过程中的作用研究进展  12-22
    1.1 CD163 分子结构、功能及表达  12-13
    1.2 CD163 作为PRRSV 受体的研究  13-18
      1.2.1 硫酸乙酰肝素  15
      1.2.2 唾液酸粘附素  15-17
      1.2.3 CD163 分子  17-18
      1.2.4 细胞蛋白酶和其它相关因子  18
    1.3 CD163 与PRRSV 相互作用研究  18-20
    1.4 PRRSV 感染过程中CD163 与IL-10 的关系  20-22
试验研究  22-55
  第二章猪CD163 基因的克隆表达  22-37
    2.1 实验材料  22-23
      2.1.1 主要试剂  22-23
      2.1.2 主要仪器设备  23
      2.1.3 实验载体和菌株  23
    2.2 实验方法  23-32
      2.2.1 表达猪CD163 基因外膜区的原核表达质粒构建  23-27
      2.2.2 重组质粒的诱导表达及鉴定  27-29
      2.2.3 重组蛋白切胶纯化  29
      2.2.4 真核表达载体构建  29-30
      2.2.5 重组质粒的酶切鉴定  30-31
      2.2.6 重组质粒的大量提取  31-32
    2.3 结果与分析  32-35
      2.3.1 猪CD163 基因胞质外区部分基因CD163 的PCR 扩增  32
      2.3.2 重组质粒的酶切鉴定  32-33
      2.3.3 重组质粒 pGEX-6P-CD163 原核表达产物的 SDS-PAGE 检测结果  33
      2.3.4 原核表达产物的Western-blot 分析  33-34
      2.3.5 真核表达猪CD163 胞质外区PCR 扩增  34-35
      2.3.6 真核表达质粒的双酶切鉴定  35
    2.4 讨论  35-36
    2.5 小结  36-37
  第三章抗猪CD163 蛋白多克隆抗体的制备与鉴定  37-45
    3.1 实验材料  37-38
      3.1.1 主要试剂  37
      3.1.2 主要仪器设备  37-38
      3.1.3 实验动物  38
    3.2 实验方法  38-40
      3.2.1 动物免疫程序  38
      3.2.2 间接ELISA 方法的建立  38-39
      3.2.3 Western Blot 检测多抗血清效价  39
      3.2.4 流式检测兔多抗血清的特异性  39
      3.2.5 抗体阻断实验  39
      3.2.6 荧光定量检测 HP-PRRSV N 基因  39-40
    3.3 结果与分析  40-43
      3.3.1 间接ELISA 检测多抗血清效价  40-41
      3.3.2 Western Blot 检测兔多抗血清效价  41-42
      3.3.3 流式检测兔抗猪多克隆抗体的特异性  42
      3.3.4 抗体阻断实验的荧光定量PCR 检测PRRSV 复制结果  42-43
    3.4 讨论  43-44
    3.5 小结  44-45
  第四章抗猪CD163 蛋白单克隆抗体的制备  45-55
    4.1 实验材料  45-46
      4.1.1 主要试剂  45
      4.1.2 主要仪器设备  45-46
      4.1.3 实验动物及细胞  46
    4.2 实验方法  46-51
      4.2.1 动物免疫程序  46
      4.2.2 骨髓瘤细胞的复苏与培养  46-47
      4.2.3 饲养层细胞的制备  47
      4.2.4 间接ELISA 方法建立  47-48
      4.2.5 免疫脾细胞的制备  48
      4.2.6 细胞融合  48-49
      4.2.7 间接ELISA 检测阳性克隆  49
      4.2.8 间接免疫荧光检测方法的建立  49-50
      4.2.9 单克隆细胞株的建立  50
      4.2.10 Western Blot 检测单抗特异性  50-51
    4.3 结果与分析  51-53
      4.3.1 间接ELISA 检测免疫小鼠血清效价  51
      4.3.2 融合杂交瘤细胞的形态观察  51-52
      4.3.3 细胞株分泌单抗间接ELISA 结果  52
      4.3.4 细胞株分泌单抗间接免疫荧光结果  52
      4.3.5 杂交瘤细胞株的筛选  52-53
      4.3.6 细胞株分泌单抗特异性测定  53
    4.4 讨论  53-54
    4.5 小结  54-55
结论  55-56
参考文献  56-61
附录  61-64
缩略词  64-65
致谢  65-66
个人简介  66

猪CD163基因的克隆表达及其抗体制备

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