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人子宫内膜窗口期基因表达平台的建立及特异基因的筛选

作　者: 王宁
导　师: 王介东
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 子宫内膜组织 窗口期 人子宫内膜 博士学位论文 医科大学 胚胎着床 协和 着床窗口 基因表达 接受状态
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


胚胎着床是哺乳动物独有的涉及胚胎和母体子宫内膜相互作用的生殖过程。此过程在时间和空间上都是高度有序的。哺乳动物的子宫内膜只有在着床窗开放时,才能接受胚泡,最终完成着床。人类的子宫内膜仅在月经周期很短的一段时期可以接受胚胎着床。大量研究证实这一时期主要受激素调控,接受态子宫内膜的形成是这一时期的一个重要事件。为了解着床窗口期事件包括接受态子宫内膜形成及胚胎着床等过程中的分子机制的全貌并深入研究着床窗口期的分子调控机制,本研究采用抑制消减杂交技术,将人着床窗口期和早泌期子宫内膜组织cDNA互相消减,构建了这两个时期的双向消减cDNA文库,并对筛选出来的部分已知和未知基因进行了深入探索。主要结果如下:1.为了构建人子宫内膜窗口期基因表达平台,我们从最初的实验材料选择就严格把关。我们以同一位志愿者的不同时相的子宫内膜作为自身对照,结合扫描电镜观察结果、B超检测结果、HE染色结果和PR免疫组化染色结果从多方面验证了材料的可靠性,为后续的分子生物学实验打下坚实的基础。2.SMARTTM PCR cDNA Synthesis技术和抑制性消减杂交技术结合起来,构建了人窗口期子宫内膜和早泌期子宫内膜双向cDNA抑制消减文库。3.在人窗口期子宫内膜cDNA文库（HWE）和人早泌期子宫内膜cDNA文库（HEW）911个PCR纯化产物进行斑点杂交分析,有354个在人窗口期和早泌期子宫内膜存在4倍以上表达差异,其中192个在窗口期差异表达,162个在早泌期差异表达。对斑点杂交筛选出的354个克隆中的130个克隆进行测序,共产生了93个质量满意的ESTs,总测序成功率达到71.54%。4.通过在互联网上的比对,在HWE文库中已知基因、已知ESTs和全新ESTs分别为52.46%、40.98%和6.56%:在HEW文库中分别为48.57%、48.57%和2.86%。5.对代表已知基因的ESTs按照功能分类,发现主要涉及细胞分裂/细胞凋亡、蛋白合成和分解、物质转运、分子伴侣、转录调控因子、信号转导、细胞骨架、粘附分子几类,并初步探讨了人子宫内膜围着床过程中差异表达基因的作用和意义。6.通过序列比对发现在HWE文库中编号为82G7的克隆序列与已知基因NID-1同源性很高,用原位杂交技术检测在窗口期和早泌期人子宫内膜的表达,结果显示NID-1在窗口期子宫内膜的基质细胞中高表达,在早泌期的子宫内膜组织中表达很弱。根据文献推测,NID-1基因的表达产物的作用可能在人类的胚胎发生、着床和蜕膜化反应中发挥重要作用。7.将人子宫内膜窗口期特异表达的克隆编号为82F4的EST序列进行RACE扩增获得一个新的cDNA序列,命名为PPI-82-F4,登录GenBank,获得登录号为EF063108。8.应用Northern杂交技术检测PPI-82-F4在窗口期和早泌期人子宫内膜的表达,结果显示PPI-82-F4在窗口期子宫内膜的表达显著高于早泌期。应用原位杂交技术检测PPI-82-F4在窗口期和早泌期人子宫内膜的表达,结果显示PPI-82-F4在窗口期子宫内膜的基质细胞和腺上皮细胞中高表达,在早泌期的子宫内膜组织中表达很弱。综上所述,我们采用抑制性消减杂交构建了双向人子宫内膜窗口期消减早泌期cDNA文库,在这两个文库中各有192和162个阳性差异的克隆,我们所得到的基因包括转录调控因子、信号转导、细胞骨架几类。母体子宫内膜从排卵到着床的过程中发生剧烈的变化,在孕激素的调控下,为了使着床窗开放做了充分准备,有很多相关基因表达。我们发现了一些基因的表达上调,同时还有一些基因表达降低或受到抑制,为我们发现潜在的新基因提供可能性。

全文目录


第一部分 人窗口期、早泌期子宫内膜差异表达文库的构建  4-86
  摘要  4-7
  Abstract  7-10
  前言  10-15
  一、人子宫内膜的获取和鉴定  15-23
    材料与方法  15-19
    实验结果  19-23
  二、人窗口期、早泌期子宫内膜抑制性消减cDNA文库的构建  23-51
    材料与方法  23-40
    实验结果  40-51
  三、差异基因的筛选、分析和鉴定  51-68
    材料与方法  51-63
    实验结果  63-68
  讨论  68-84
  结论  84-86
第二部分 小鼠子宫内膜pinopodes观察  86-99
  前言  86-88
  材料与方法  88-92
  实验结果  92-94
  讨论  94-98
  结论  98-99
文献综述  99-122
参考文献  122-133
英、汉名词对照  133-134
致谢  134

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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