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对虾白斑综合征病毒（WSSV）灭活制剂及多糖对克氏原螯虾抗WSSV作用的研究

作　者: 朱斐
导　师: 许梓荣
学　校: 浙江大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 对虾白斑综合征病毒 BEI 多糖 灭活 相对存活率 囊膜蛋白
分类号: S945.46
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


对虾白斑综合征病毒(WSSV)是对全球对虾养殖业危害最大,传播最广的病毒之一,尤其是对中国对虾养殖业带来了毁灭性的打击,至今已经造成了数十亿美元的损失。但目前尚无行之有效的防治手段,因此寻找预防和控制该病毒病一直是近年来的研究热点。许多研究结果表明WSSV囊膜蛋白可以诱导甲壳动物产生对WSSV的抵抗力,从而大幅提高WSSV攻毒后的成活率。多糖(如葡聚糖、壳聚糖、甲壳素)也被认为能提高甲壳动物的免疫力,并被广泛用于提高甲壳动物抗细菌性和病毒性疾病的研究。本研究从制作WSSV灭活制剂着手,经口服途径免疫克氏原螯虾,进行主动免疫保护克氏原螯虾抗WSSV感染的效果试验,并初步研究WSSV灭活制剂的保护作用机理。同时在螯虾饲料中添加不同比例(5mg/g、10mg/g、15mg/g)的三种多糖(壳聚糖、甲壳素、葡聚糖),研究多糖对克氏原螯虾抗WSSV感染的影响。主要研究内容和结果如下：1 BEI灭活WSSV制剂(BIW)的研制应用双乙烯亚胺(Binary Ethyleneimine, BEI)灭活WSSV,经螯虾肌肉注射试验证实白斑综合征病毒(WSSV)在2mM BEI,37℃下处理24h可以被完全灭活,注射试验表明死亡率为零,同时PCR检测也表明受试螯虾没有感染WSSV,结果表明BEI灭活WSSV制剂(BIW)对于螯虾是安全的。对BEI灭活WSSV的PCR检测证明了BEI的作用是破坏病毒的DNA分子,虽然扫描电镜观察发现WSSV粒子的囊膜表面有轻微的变化,但是SDS-PAGE分析说明结构蛋白的基本组成几乎没有改变,在灭活后WSSV的主要囊膜蛋白VP19. VP28. VP281、VP38A、VP51B和VP110等条带均清晰可辨,说明BEI的灭活作用对WSSV的囊膜蛋白基本无损坏影响,从而保持了其诱导甲壳动物抗白斑综合征的能力。2口服BIW诱导螯虾抗白斑综合征效果的研究结果表明口服BIW能显著提高克氏原螯虾攻毒后的相对存活率。不同次数口服免疫试验表明,随着口服BIW次数的增多,螯虾对WSSV的抵抗力也相应增强,但随着口服次数增多差异也越小,结果显示口服三次BIW就可以诱导螯虾对WSSV产生较强的抵抗力。口服三次BIW后,螯虾在第7、14、21、28天攻毒的相对存活率RPS分别为70%、53%、38%和20%,均显著高于对照组(P<0.05)。但是口服BIW螯虾的死亡率随着攻毒时间的推后也持续的升高,存活率随之下降,在14天之内口服BIW的螯虾可以保持50%以上的存活率。口服BIW的螯虾在口服结束后第一天血清酚氧化酶活力、超氧化物歧化酶活力和溶菌酶活力均有一定程度的提高,但差异不显著(P>0.05)；口服BIW结束后第七天四种酶活力水平有显著的提高(P<0.05),后逐步下降,至第4周基本与对照组无明显差异。PCR检测结果发现,病死螯虾的肝胰腺、中肠、肌肉、鳃、性腺、心脏六种组织的PCR结果均为WSSV阳性,而口服BIW螯虾的各组织检测结果均为阴性。光镜和电镜观察也证实了这一点,病死螯虾的肝胰腺、中肠、肌肉、鳃、性腺、心脏等组织均发生了不同程度的病变,而口服BIW螯虾的组织结构形态与健康螯虾无明显差异。3 BIW诱导螯虾抗白斑综合征机理的研究口服BIW的螯虾,在口服结束后第7天和第21天后攻毒存活率均显著高于对照组(P<0.05),相对存活率分别为60%和42%,而口服热灭活WSSV的相对存活率仅为10%和5%。注射BIW的螯虾在免疫结束第7天和21天后攻毒存活率均显著高于对照组,相对存活率分别为75%和60%。而注射热灭活WSSV的相对存活率仅为10%和5%。另外,电镜观察发现在BEI灭活WSSV的囊膜表面仅有轻微的变化,而热灭活WSSV的囊膜则几乎从核衣壳上脱落,说明BEI灭活对WSSV囊膜的影响要比热灭活小的多。SDS-PAGE也证明了这一点,BEI灭活WSSV可见VP19、VP28、VP281等囊膜蛋白条带都十分清晰,而热灭活WSSV则未见清晰的条带。对照攻毒试验说明WSSV灭活制剂所提供的保护作用是与灭活WSSV囊膜蛋白密切相关的。4多糖添加剂对克氏原螯虾抗WSSV影响的研究在虾饲料中添加不同比例(5mg/g、10mg/g、15 mg/g)的三种多糖(壳聚糖、甲壳素、葡聚糖),连续投喂20天以后口服攻毒。结果发现,与阳性对照相比,壳聚糖组5 mg/g、10 mg/g和15]mg/g三个浓度的相对存活率分别为25%、40%和25%；甲壳素组三个浓度的相对存活率分别为5%、15%和15%；葡聚糖组三个浓度的相对存活率分别为20%、25%和30%。其中以10mg／g壳聚糖组的保护作用最好,15mg／g葡聚糖组次之,相对存活率均显著高于对照组(P<0.05)。但同种多糖添加剂不同浓度的相对存活率之间却无显著差异(P>0.05)。酶活力测定发现,壳聚糖、甲壳素、葡聚糖对螯虾酶活力的提高作用以葡聚糖最好,壳聚糖次之,甲壳素则较差。而10 mg/g壳聚糖组的酶活力水平相对较高,与该组较高的存活率相一致。结果表明,上述四种酶活力水平可能与螯虾抗WSSV的能力有一定的相关性。研究发现,2mM双乙烯亚胺(BEI)对WSSV有确切的灭活效果,BEI灭活的WSSV经PCR检测和SDS-PAGE分析表明,BEI破坏了病毒的DNA,而对WSSV的囊膜蛋白无损坏影响,保持了其诱导甲壳动物抗白斑综合征的能力。三次可使螯虾对WSSV产生较强的抵抗力,在14天之内攻毒可以保持50%以上的存活率,且螯虾血清酚氧化酶活力、超氧化物歧化酶活力、溶菌酶活力均显著提高。通过光镜和电镜观察发现,口服BEI灭活WSSV攻毒后存活螯虾的肝胰腺、中肠、肌肉、鳃、性腺、心脏六种组织均未感染WSSV,且PCR结果均为WSSV阴性。对照攻毒试验表明,WSSV灭活制剂所诱导的对白斑综合征的抵抗力是与灭活WSSV囊膜蛋白密切相关的。

全文目录


致谢  5-6
摘要  6-9
Abstract  9-12
缩略语表  12-14
目录  14-17
第一章 绪论  17-35
  第一节 对虾白斑综合征病毒研究进展  17-21
    1 对虾白斑综合征病毒概况  17-18
    2 WSSV结构蛋白的研究进展  18-19
    3 对虾白斑综合征病毒致病机理的研究  19-20
    4 双乙烯亚胺研究进展  20-21
    5 克氏原螯虾的生物学  21
  第二节 甲壳动物的免疫系统与免疫因子  21-28
    1 细胞免疫  21-23
    2 体液免疫  23-27
      2.1 凝集素  23
      2.2 酚氧化酶原激活系统  23-25
      2.3 抗菌肽  25-26
      2.4 热休克蛋白  26-27
    3 特异性免疫  27-28
  第三节 对虾白斑综合征防治研究进展  28-32
    1 亚单位疫苗  28-29
    2 siRNA基因干扰  29-30
    3 特异性中和抗体  30
    4 多糖类饲料添加剂  30-31
    5 中草药制剂  31-32
  第四节 本研究的目的、意义及主要内容  32-35
第二章 BEI灭活WSSV制剂(BIW)的研制  35-53
  第一节 试验材料  36-39
    1 种毒与试验动物  36
    2 试验螯虾饲料  36
    3 仪器设备和其它材料  36-37
    4 主要化学试剂配制  37-39
  第二节 试验方法  39-44
    1 对虾白斑综合征病毒增殖  39
    2 WSSV的分离纯化  39-40
    3 WSSV透射电镜观察  40
    4 病毒体内滴定试验  40
    5 WSSV灭活制剂的制作  40
    6 WSSV的PCR检测  40-42
    7 SDS-PAGE  42-44
    8 BEI对WSSV的灭活效果试验  44
  第三节 结果与分析  44-50
    1 病毒增殖  44-45
    2 病毒体内滴定  45-47
    3 BEI对WSSV的灭活效果试验  47-50
  第四节 讨论  50-53
第三章 口服BIW诱导螯虾抗WSSV效果的研究  53-79
  第一节 试验材料  54-56
    1 种毒与试验动物  54
    2 试验螯虾饲料  54
    3 仪器设备和其它材料  54-55
    4 主要化学试剂配制  55-56
  第二节 试验方法  56-59
    1 蜂胶包被攻毒试验  56
    2 口服BIW预试验  56-57
    3 口服BIW不同次数效果试验  57
    4 口服BIW后不同时段攻毒试验  57
    5 WSSV的PCR检测  57
    6 血清酶活力测定  57-58
    7 光镜组织切片观察  58-59
    8 透射电镜组织切片观察  59
    9 数理统计  59
  第三节 结果与分析  59-75
    1 蜂胶包被攻毒效果  59-60
    2 口服BIW预试验  60-61
    3 口服BIW不同次数效果试验  61-62
    4 口服BIW后不同时段攻毒试验  62-63
    5 WSSV的PCR检测  63-64
    6 血清酶活力测定  64-65
    7 攻毒后螯虾的组织光镜观察  65-67
    8 攻毒后螯虾的组织电镜观察  67-75
  第四节 讨论  75-79
第四章 BIW诱导螯虾抗WSSV作用机理研究  79-95
  第一节 试验材料  80-81
    1 种毒与试验动物  80
    2 试验螫虾饲料  80
    3 仪器设备和其它材料  80-81
  第二节 试验方法  81-83
    1 不同方式灭活WSSV诱导螯虾抗WSSV试验  81
    2 口服和注射BIW对不同攻毒方式保护效果试验  81
    3 口服和注射BIW螯虾血清模拟中和试验  81-82
    4 WSSV的PCR检测  82
    5 WSSV透射电镜观察  82
    6 SDS-PAGE  82
    7 数理统计  82-83
  第三节 结果与分析  83-91
    1 不同方式灭活WSSV试验  83
    2 口服不同方式灭活WSSV诱导螯虾抗WSSV试验  83-85
    3 注射不同方式灭活WSSV诱导螯虾抗WSSV试验  85-87
    4 透射电镜观察  87-88
    5 SDS-PAGE分析  88
    6 口服和注射BIW对不同攻毒方式保护效果试验  88-90
    7 口服和注射BIW螯虾血清模拟中和试验  90-91
  第四节 讨论  91-95
第五章 多糖类添加剂对螯虾抗WSSV影响的研究  95-106
  第一节 试验材料  96-97
    1 种毒与试验动物  96
    2 试验螯虾饲料  96-97
    3 仪器设备和其它材料  97
  第二节 试验方法  97-99
    1 多糖添加剂保护性试验  97-98
    2 WSSV的PCR检测和电镜观察  98
    3 血清酶活力测定  98-99
    4 数理统计  99
  第三节 结果与分析  99-104
    1 多糖添加剂保护性试验  99-102
    2 WSSV的PCR检测和电镜观察  102
    3 血清酶活力测定  102-104
  第四节 讨论  104-106
第六章 论文提示、创新点及后续研究展望  106-108
参考文献  108-132
作者简历及在学期间所取得的科研成果  132

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 甲壳类病虫害及其防治 > 各种虾的病虫害及其防治 > 对虾（明虾）
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