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山茶蜂花粉多糖的分离纯化和免疫活性研究

作　者: 刘恩绪
导　师: 周义发
学　校: 东北师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 蜂花粉多糖分级免疫活性
分类号: S896.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

山茶(Camellia japonica)属于山茶科山茶属植物,根和花可入药。山茶蜂花粉是一种营养丰富的物质,具有很好的保健作用。目前,山茶蜂花粉多糖的研究主要集中在活性上,对山茶蜂花粉多糖分离纯化上的研究尚未见报道。本论文主要研究了山茶蜂花粉多糖的分离纯化及免疫活性。山茶蜂花粉经过热水煮提,过滤,浓缩,乙醇沉淀,获得山茶蜂花粉总多糖(WCPP),经分析得到山茶蜂花粉多糖的单糖组成为:2.5% Man、7.8% Rha、3.0% GlcA、37.0% GalA、12.5% Glc、15.1% Gal和22.1% Ara,并通过凝胶柱对其进行检测,发现分子量分布不均一。本论文采用两种方法对WCPP进行分级:第一,采用乙醇沉淀的方法对WCPP进行分级,分别用30%、50%、70%和80%乙醇对WCPP进行沉淀,获得四个级份WCPP-30、WCPP-50、WCPP-70和WCPP-80。单糖组成分析表明:WCPP-30含有4.3% Man、7.4% Rha、45.4% GalA、10.6% Glc、10.3% Gal、2.1% Xyl和20.2% Ara;WCPP-50含有2.0% Man、9.1% Rha、42.7% GalA、8.8% Glc、11.5% Gal、2.0% Xyl和23.9% Ara;WCPP-70含有2.1% Man、8.7% Rha、1.9% GlcA、15.5% GalA、16.3% Glc、20.6% Gal、1.5% Xyl和33.5% Ara;WCPP-80含有6.3% Man,4.7% Rha、4.8% GalA、42.6% Glc、12.2% Gal和29.4% Ara。采用凝胶柱层析方法对四个级份进行了均一性鉴定,发现其分子量分布范围较宽,不易根据分子量进一步分级。第二,采用离子交换柱层析方法对WCPP进行分级,分别用水、0.1 mol/l NaCl、0.3 mol/l NaCl和0.5 mol/l NaCl进行洗脱,获得四个级份:WCPP-N、WCPP-1、WCPP-2和WCPP-3。对四个级份进行单糖组成分析得到:WCPP-N含有4.1% Man、1.0% Rha、69.0% Glc、13.4% Gal和12.7% Ara;WCPP-1含有5.4% Man、4.3% Rha、2.5% GlcA、45.0% GalA、22.7% Gal、18.0% Ara和2.0% Glc;WCPP-2含有1.0% Man、9.5% Rha、1.9% GlcA、30.2% GalA、1.9% Glc、19.3% Gal和36.5% Ara;WCPP-3含有2.1% Man、18.8% Rha、1.1% GlcA、33.2% GalA、17.9% Glc、19.1% Gal和23.9% Ara。凝胶柱层析检测发现四个级份分子量分布比较广泛。WCPP-1和WCPP-3含量比较低,未对其进行分离纯化,主要对WCPP-N和WCPP-2进行了进一步纯化。采用Sephadex G-100凝胶柱层析方法对WCPP-N进行分离纯化,获得WCPP-N-Ⅰ和WCPP-N-Ⅱ两个级份。经检测发现,WCPP-N-Ⅱ的分子量均一性比WCPP-N-Ⅰ好,因此对WCPP-N-Ⅱ进行了结构分析,核磁结果显示,这个级分的主链由α-1,4-Glucan,侧链由α-1,6-Glucan构成,具有支链淀粉样结构。采用Sepharose Cl-6B凝胶柱层析方法对WCPP-2进行纯化,得到WCPP-2-Ⅰ、WCPP-2-Ⅱ、WCPP-2-ⅡⅠ、WCPP-2-ⅠV和WCPP-2-V。经检测发现,WCPP-2-Ⅰ比较均一,其他四个级份不均一。因此对WCPP-2-Ⅰ进行了结构分析,核磁结果显示,WCPP-2-Ⅰ可能含有α-1,2-Rha或α-1,2,4-Rha与α-1,4-GalA交替形成的主链,Rha的4位带有侧链分支,侧链主要为α-1,5-Ara形成的阿拉伯聚糖,还有少量β-1,4-Gal形成的半乳聚糖。通过体内和体外巨噬细胞吞噬实验可知,山茶蜂花粉WCPP-3级份可以促进机体的巨噬细胞吞噬,但是这种促进作用并不是直接作用在细胞上,可能通过作用于其他细胞,产生相应的细胞因子,最终促进了巨噬细胞的吞噬功能。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
中英文对照及英文缩写词表  8-11
第一章前言  11-27
  1.1 多糖研究进展  11-23
    1.1.1 多糖的提取  11-12
    1.1.2 多糖的分离纯化  12-14
    1.1.3 多糖纯度的鉴定以及分子量的测定  14-15
    1.1.4 多糖组成的测定  15
    1.1.5 多糖结构的确定  15-17
    1.1.6 果胶结构的研究现状  17-22
    1.1.7 多糖的生物活性研究进展  22-23
  1.2 蜂花粉多糖的研究进展  23-26
    1.2.1 蜂花粉简介  23-24
    1.2.2 蜂花粉多糖  24
    1.2.3 蜂花粉多糖的提取方法  24-25
    1.2.4 蜂花粉多糖的活性研究  25-26
  1.3 论文的选题依据  26-27
第二章山茶蜂花粉多糖的提取  27-37
  2.1 材料  27-28
    2.1.1 仪器  27
    2.1.2 试剂和药品  27-28
  2.2 实验方法  28-31
    2.2.1 山茶蜂花粉总糖的提取  28
    2.2.2 一般方法  28
    2.2.3 测定糖含量的方法  28-29
    2.2.4 糖醛酸含量测定的方法  29-30
    2.2.5 蛋白质含量的测定方法  30
    2.2.6 多糖均一性以及分子量的测定  30-31
    2.2.7 单糖组成的测定方法  31
  2.3 实验结果  31-35
    2.3.1 山茶蜂花粉多糖的提取  31-32
    2.3.2 糖含量测定  32-33
    2.3.3 糖醛酸含量测定  33
    2.3.4 蛋白质含量测定  33-34
    2.3.5 WCPP 均一性的检测  34-35
    2.3.6 WCPP 单糖组成的检测  35
  2.4 讨论  35-36
  2.5 小结  36-37
第三章山茶蜂花粉多糖的分级和结构研究  37-55
  3.1 材料  37
    3.1.1 试剂和药品  37
    3.1.2 仪器  37
  3.2 实验方法  37-39
    3.2.1 WCPP 分级—乙醇沉淀法  37-38
    3.2.2 WCPP 的分级—离子交换法  38
    3.2.3 WCPP-N 的分离纯化  38
    3.2.4 WCPP-2 的分离纯化  38
    3.2.5 糖含量及糖醛酸含量的测定  38
    3.2.6 单糖组成的测定  38
    3.2.7 均一性和分子量的测定  38-39
    3.2.8 核磁共振法分析结构  39
    3.2.9 WCPP-N-Ⅱ 理化性质的分析  39
    3.2.10 WCPP-2-Ⅰ 理化性质的分析  39
  3.3 实验结果  39-53
    3.3.1 总糖分级方法的探索  39-45
    3.3.2 WCPP-N 的分离纯化及结构鉴定  45-48
    3.3.3 WCPP-2 的分离纯化及理化性质的研究  48-51
    3.3.4 WCPP-2-Ⅰ 的理化性质及结构分析  51-53
  3.4 讨论  53
  3.5 小结  53-55
第4 章山茶蜂花粉多糖的免疫活性研究  55-60
  4.1 材料与方法  55-57
    4.1.1 材料  55
    4.1.2 实验动物  55
    4.1.3 试剂  55-56
    4.1.4 器材及仪器  56
    4.1.5 实验方法  56-57
  4.2 结果与讨论  57-58
    4.2.1 体内实验结果  57
    4.2.2 体外实验结果  57-58
  4.3 小结  58-60
参考文献  60-65
致谢  65

山茶蜂花粉多糖的分离纯化和免疫活性研究

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