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PARP-1对RAW264.7细胞内HMGB1的定位和分泌的影响

作　者: 原伟伟
导　师: 吴河水
学　校: 华中科技大学
专　业: 外科学
关键词: 高迁移率族蛋白1(HMGB1) 聚ADP-核糖基聚合酶1(PARP-1) 脂多糖(LPS) 核定位序列(NLS) 3-氨基苯甲酰胺(3-AB)
分类号: R576
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:研究聚ADP-核糖基聚合酶1(PARP-1)对RAW264.7细胞内HMGB1定位和分泌的影响,从亚细胞结构来观察HMGB1由胞核向胞浆移位的过程,为研究重症急性胰腺炎的治疗提供新的策略。方法:用100ng/ml的LPS处理RAW264.7细胞1、2、4、8和16h,运用cell ELISA测定刺激后细胞内PARP-1活性变化的时间规律;用LPS(100ng/ml)、LPS+3-AB(10mmol/l)刺激RAW264.7细胞1、2、4、8和16h,运用细胞免疫荧光在荧光显微镜下观察HMGB1在细胞内定位的时间变化规律,运用Western-blot的方法检测HMGB1在细胞培养上清中的水平;构建HMGB1-EGFP(wild type, WT)的表达质粒和HMGB1NLS区域第40、47、179位谷氨酸突变为丙氨酸的HMGB1-EGFP(mutated type, MT)的表达质粒,通过瞬时转染到RAW264.7细胞中,用100ng/ml的LPS处理转染后的细胞,在荧光显微镜下观察HMGB1在细胞内定位的情况。结果: LPS刺激RAW264.7后,细胞中PARP-1活化,活性增强,在刺激后4小时达到高峰,随后活性逐渐降低;HMGB1在刺激后1h开始由胞核向胞浆移位,随着刺激时间的延长,逐渐向胞浆集聚;抑制PARP-1的活性可以减少HMGB1由胞核向胞浆的移位,抑制HMGB1向细胞外的分泌;HMGB1 NLS区域的谷氨酸突变后,不会减弱HMGB1由胞核向胞浆的移位,对HMGB1细胞内定位没有影响。结论:PARP-1参与了RAW264.7细胞内HMGB1的定位和分泌,它通过对HMGB1蛋白进行ADP-核糖基化修饰,来调控HMGB1在细胞中的定位及细胞外的分泌。HMGB1 NLS区域的谷氨酸突变对HMGB1的细胞内定位没有影响。3-AB通过抑制PARP-1的活性进而抑制HMGB1的ADP-核糖基化修饰,从而抑制HMGB1向胞浆的移位和细胞外的分泌过程。PARP-1抑制剂可以抑制HMGB1向细胞内定位和细胞外分泌,为HMGB1引起的炎症反应的治疗提供了新的思路。

全文目录

前言  5-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-10
实验仪器、试剂  10-13
实验方法  13-16
结果  16-21
讨论  21-27
结论  27-28
参考文献  28-31
综述  31-40
  参考文献  37-40
附录  40-41
英文缩写词表  41-42
致谢  42

PARP-1对RAW264.7细胞内HMGB1的定位和分泌的影响

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