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葛根异黄酮的分离纯化和葛藤的初步研究

作　者: 仰玲玲
导　师: 吴向阳
学　校: 江苏大学
专　业: 食品科学
关键词: 野葛 异黄酮 粗多糖 挥发油 HPLC 树脂纯化 GC-MS 抗氧化活性
分类号: TS209
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


葛根（Raix Puerariae）是一种传统中药,含有多种有效成分,其中以葛根素、大豆苷和大豆苷元等异黄酮类成分为主。葛根素可用于治疗心血管疾病、心绞痛和心率失常等疾病,大豆苷和大豆苷元可用于治疗和预防妇女疾病。目前对葛根异黄酮的分析和分离纯化,主要针对葛根素,降低了葛根自身的利用价值。此外,目前我国野葛（Puerariae Lobata（wild）Ohwi）的研究和开发都集中在葛根与葛花部位,而对葛藤部位的分析主要为异黄酮类成分,对其它有效成分的分析以及生物活性的研究少。为进一步研究和开发茅山地区的野葛资源,本文以茅山地区的葛根和葛藤为研究对象,研究葛根异黄酮的分析方法、分离纯化工艺和葛藤的化学成分分析及抗氧化活性,为葛根产品质量标准的建立和茅山野葛的全面开发和综合利用提供基础。目前对江苏茅山地区的野葛中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量的同时测定研究未见报道,2005版药典中关于葛根中测定葛根素的前处理是否适用于葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元的同时测定有待研究。因此,本文研究同时测定野葛中葛根素、大豆苷和大豆苷元的前处理和反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析方法。样品前处理采用70%乙醇50℃超声提取20min,RP-HPLC直接测定,并与药典方法进行对比。对照品葛根素、大豆苷和大豆苷元分别在0.2140～1.2840,0.0178～0.1066和0.0044～0.0026μg范围内呈良好线性关系,相关系数r分别为0.9998,0.9997和0.9994,平均回收率分别为99.46%,104.29%和111.54%,RSD分别为2.20%,4.60%和6.60%（n=5）。精密度、稳定性和重现性良好。超声提取法测得的葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分别为3.98%,0.36%和0.039%,高于药典提取法测得的这3种化合物含量,更适于同时提取葛根素、大豆苷和大豆苷元。葛茎中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分别为40mg/kg,32mg/kg和6.6mg/kg,葛叶中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分别为16mg/kg,50mg/kg和12mg/kg。该方法准确、快速,操作简单,分离效果好,可用于野葛的根、茎和叶中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量的同时测定;江苏茅山地区野葛茎和叶中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量大大低于葛根中的含量。目前关于葛根异黄酮的大孔树脂纯化方法的报道很多,但主要都是对葛根素进行纯化。本文重点研究一种能同时从葛根中获取多种有效成分葛根素、大豆苷和大豆苷元的大孔树脂纯化法。通过静态吸附、静态解吸试验考察AB-8、D-101、NKA和D1300四种大孔吸附树脂对葛根总黄酮的吸附量和解析率,优选出AB-8树脂为最佳树脂,并且考察和优化AB-8分离纯化葛根总黄酮的工艺条件。结果表明,AB-8树脂对葛根总黄酮的吸附效果较好,吸附量达116.33 mg/g;Langmuir方程能较好的描述其吸附等温线;AB-8树脂分离纯化葛根总黄酮工艺的适宜条件为进样质量浓度9.63g/L,流速1.5 mL/min,用蒸馏水洗脱多糖杂质后,采用10%,30%,50%,70%乙醇依次梯度洗脱,分部收集洗脱液,减压浓缩,冷冻干燥,可得到不同活性成分的纯化物。10%乙醇洗脱可得到以葛根素为主要活性成分的纯化物,含量为87.17%;30%乙醇洗脱可得到以葛根素和大豆苷为主要活性成分的纯化物,葛根素和大豆苷含量分别为53.72%和18.41%;50%乙醇和70%乙醇洗脱得到以大豆苷元为主的洗脱液,大豆苷元含量分别为72.41%和74.31%。因此梯度洗脱可获得不同活性成分的精制异黄酮。茅山地区葛藤中异黄酮成分葛根素、大豆苷和大豆苷元含量很低,为进一步研究葛藤中是否含有其他活性成分,本文对茅山地区野葛藤的不同提取部位进行了初步研究。采用水蒸气蒸馏-乙醚萃取法、醇提法和水提醇沉法对野葛藤进行提取,得到挥发油、醇提物和粗多糖三种不同提取部位,并对其成分进行初步分析。采用硫酸催化甲酯化衍生化方法对葛藤挥发油进行气相质谱（GC-MS）分析,结果表明,葛藤分离出的153个组分中可鉴定组分70个,其中醇类化合物（9个）占总量的7.44%;酮类化合物（2个）占4.41%;烯烃类化合物（3个）占0.65%;烷烃类化合物（5个）占0.76%;醛类化合物（7个）占0.43%;烷酸类化合物(22个占53.23%;烯酸类化合物（11个）占18.45%;芳烃类化合物（4个）占0.65%;酯类化合物（4个）占3.55%;酚类化合物（1个）占0.25%;其他化合物（1个）占1.35%。采用2种分光光度法对野葛藤醇提物的总黄酮含量进行测定。结果表明,以芦丁为对照品的UV测定方法测得的总黄酮含量为5.66%,以葛根素为对照品的UV测定方法测得的总黄酮含量为1.95%。对水提醇沉得到的粗多糖含量进行测定,葛藤粗多糖的得率为8.39%,粗多糖中多糖含量为30.31%,可见茅山地区的葛藤含有较为丰富的多糖类物质。用DPPH法、邻二氮菲法和邻苯三酚自氧化法研究了葛藤挥发油、醇提物和粗多糖清除自由基活性。结果表明,葛藤醇提物、粗多糖和挥发油都具有良好的清除自由基活性,且清除效果都是粗多糖最强,醇提物次之,挥发油的抗氧化活性最弱。对于DPPH·,挥发油、醇提物和粗多糖的IC50值分别为3.3011、1.0767和0.1229mg/mL(Vc的IC50值为0.0091 mg/mL);对于·OH,挥发油、醇提物和粗多糖的IC50值分别为3.0755、1.5615和0.7511mg/mL(Vc的IC50值为0.3477mg/mL)。;对于O2-,挥发油、醇提物和粗多糖的IC50值分别为2.3424、1.1460和0.9229mg/mL(Vc的IC50值为0.2299 mg/mL)。可见,葛藤的粗多糖和醇提物具有较好的抗氧化活性,其抗氧化活性成分有待进一步研究,茅山地区葛藤有深入研究价值。

全文目录


摘要  5-8
ABSTRACT  8-15
第一章 绪论  15-27
  1.1 葛属植物的研究现状  15-21
    1.1.1 葛化学成分的研究进展  15-18
    1.1.2 药理活性研究  18-21
  1.2 葛根异黄酮的分析和分离纯化方法的研究进展  21-25
    1.2.1 葛根异黄酮的分析方法  21-23
    1.2.2 葛根异黄酮的分离纯化方法  23-25
  1.3 立题目的与意义  25-26
  1.4 主要研究内容  26-27
第二章 RP-HPLC法同时测定野葛的根、茎和叶中葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量  27-37
  2.1 材料与仪器  27-28
    2.1.1 材料与试剂  27-28
    2.1.2 主要仪器  28
  2.2 实验方法  28-29
    2.2.1 色谱条件  28
    2.2.2 对照品溶液的制备  28
    2.2.3 样品溶液的制备  28-29
  2.3 结果与讨论  29-35
    2.3.1 检测波长的选择  29
    2.3.2 色谱条件的选择  29-31
    2.3.3 前处理条件的选择  31-32
    2.3.4 方法学考察  32-35
  2.4 本章小结  35-37
第三章 树脂吸附法分离纯化葛根异黄酮  37-48
  3.1 材料与仪器  37-38
    3.1.1 材料与试剂  37
    3.1.2 主要仪器  37-38
  3.2 实验方法  38-40
    3.2.1 葛根总黄酮粗提物的制备  38
    3.2.2 树脂的预处理  38
    3.2.3 葛根总黄酮含量测定  38-39
    3.2.4 葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元的HPLC测定  39
    3.2.5 静态吸附量和解吸率的测定  39
    3.2.6 洗脱剂的选择  39
    3.2.7 动态吸附性能的考察  39-40
  3.3 结果与讨论  40-47
    3.3.1 树脂的筛选  40
    3.3.2 吸附等温线的测定  40-41
    3.3.3 洗脱剂的选择  41-42
    3.3.4 动态吸附的考察  42-43
    3.3.5 水洗量的考察  43-44
    3.3.6 不同洗脱方式的考察  44-47
  3.4 本章小结  47-48
第四章 葛藤不同提取部位的成分分析  48-57
  4.1 材料与仪器  48-49
    4.1.1 材料与试剂  48
    4.1.2 主要仪器  48-49
  4.2 实验方法  49-50
    4.2.1 葛藤不同提取物的制备  49
    4.2.2 葛藤不同提取部位的分析  49-50
  4.3 结果与讨论  50-55
    4.3.1 葛藤挥发油成分分析  50-55
    4.3.2 葛藤醇提物总黄酮的测定  55
    4.3.3 葛藤粗多糖的含量测定  55
  4.4 本章小结  55-57
第五章 葛藤不同提取部位的抗氧化活性比较  57-64
  5.1 材料与仪器  57
    5.1.1 材料与试剂  57
    5.1.2 主要仪器  57
  5.2 实验方法  57-59
    5.2.1 清除DPPH自由基试验  57-58
    5.2.2 清除羟自由基(·OH)试验  58
    5.2.3 清除超氧自由基(O_2~-·)试验  58-59
  5.3 结果与讨论  59-63
    5.3.1 清除DPPH自由基效果  59-60
    5.3.2 清除羟基自由基(-OH)效果  60-62
    5.3.3 清除超氧自由基(O_2~-·)效果  62-63
  5.4 本章小结  63-64
第六章 结论与展望  64-67
  6.1 主要结论  64-66
  6.2 工作展望  66-67
参考文献  67-72
致谢  72-73
攻读硕士学位期间发表的论文目录  73

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 食品工业副产品加工与利用
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