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萍乡红鲫ZP3蛋白组织差异性表达及其在卵母细胞中免疫荧光定位

作　者: 史建伍
导　师: 洪一江
学　校: 南昌大学
专　业: 水产养殖学
关键词: 萍乡红鲫 ZP3 荧光定量PCR RACE-PCR 免疫荧光
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 54次
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内容摘要


萍乡红鲫(Pingxiang red-transparent crucian carp, Carassius auratus var. Pingxiangnensis)主要分布于江西省萍乡地区,是三倍体野生鲫鱼的一种突变种。因其通体呈肉红色、透明而得名肉红鲫,是一种集食用和观赏价值于一体的鲫鱼品种,在2008年被国家水产原良种委员会审定为新的养殖品种-萍乡红鲫。萍乡红鲫可以行雌核发育和两性生殖两种生殖方式。本论文主要包括以下三部分：一、利用RACE-PCR技术克隆得到萍乡红鲫ZP3基因cDNA全长序列,该序列全长1385bp,有一个1308bp的完整开放阅读框,编码435个氨基酸,经过氨基酸序列比对,121-376位氨基酸残基属于ZP家族domain超家族结构域。二、利用荧光定量PCR的方法检测了ZP3基因在萍乡红鲫卵巢、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑等组织中的差异性表达,相对定量分析结果显示ZP3基因在肝脏中表达量最低,在卵巢组织中的表达量显著多于其他五个组织,约是肝脏中的26656倍,除卵巢组织外,ZP3基因在所检测的其他五个组织中都有微量的表达。三、将纯化好的ZP3蛋白作为抗原免疫白兔,制备得到了多克隆兔抗鱼ZP3蛋白血清。用Elisa间接法检测了抗血清的效价。将得到的抗血清用于卵母细胞冰冻切片免疫荧光定位实验。Elisa实验结果显示：抗血清效价约为25600且抗血清的特异性良好。免疫荧光实验结果显示：在早期发育的卵母细胞中,就有少量的ZP3蛋白存在,随着卵母细胞的发育,ZP3蛋白的合成累积量逐渐增加。在V时相的卵母细胞中,ZP3蛋白在卵母细胞细胞膜上和细胞质中的存在量达到了最大。ZP3蛋白在精卵识别的过程中起到了关键作用。本研究为进一步了解萍乡红鲫ZP3蛋白在受精时的具体功能,提供了一点分子生物学方面的数据。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
第一章 文献综述  9-16
  1.1 卵透明带(zona pellucida,ZP)研究进展  9
  1.2 关于ZP3的研究进展  9-14
    1.2.1 关于ZP3 cDNA序列克隆  10-11
    1.2.2 关于ZP3基因转录和蛋白的合成位点  11-12
    1.2.3 关于ZP3精子受体功能  12-13
    1.2.4 ZP3蛋白在不同卵母细胞发育时期中的存在量和表达量  13-14
  1.3 本论文的研究目的和意义  14-16
第二章 萍乡红鲫ZP3基因cDNA序列克隆及其组织差异性表达分析  16-39
  2.1 材料和方法  16-23
    2.1.1 实验材料  16
    2.1.2 RACE-PCR引物设计  16-17
    2.1.3 萍乡红鲫多个组织总RNA提取  17-18
    2.1.4 用SuperScriptTM Ⅱ RT合成ZP3 cDNA第一链  18-19
    2.1.5 扩增萍乡红鲫ZP3基因cDNA全长  19-20
    2.1.6 回收目的片段,与载体连接,感受态细胞制备以及转化测序  20-22
    2.1.7 荧光定量PCR检测ZP3基因在萍乡红鲫不同组织中的差异表达  22-23
  2.2 实验结果与分析  23-36
    2.2.1 多个组织RNA的提取  23-25
    2.2.2 萍乡红鲫ZP3基因全长克隆  25-27
    2.2.3 萍乡红鲫ZP3基因cDNA序列及其氨基酸序列分析  27-31
    2.2.4 萍乡红鲫ZP3基因的进化以及同源性分析  31-32
    2.2.5 荧光定量PCR检测萍乡红鲫ZP3基因组织差异性表达  32-36
  2.3 讨论  36-39
第三章 萍乡红鲫ZP3糖蛋白多克隆抗体制备及在卵母细胞中的免疫荧光定位  39-47
  3.1 实验材料和方法  39-41
    3.1.1 兔抗萍乡红鲫ZP3蛋白血清的获得  39-40
    3.1.2 Elisa检测抗血清效价  40
    3.1.3 ZP3蛋白在卵母细胞上的免疫荧光定位  40-41
  3.2 实验结果  41-45
    3.2.1 Elisa检测抗血清效价结果  41-42
    3.2.2 ZP3蛋白在卵母细胞上的免疫荧光定位  42-45
  3.3 讨论  45-47
致谢  47-48
参考文献  48-52
附录  52-57
攻读学位期间的研究成果  57

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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